高強(qiáng)度間歇游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)有訓(xùn)練大鼠心肌miRNA的差異表達(dá)及相關(guān)調(diào)控通路分析

胡榮光，趙彥宏，張瑞萍，張安民*，錢帥偉

（1.山西財(cái)經(jīng)大學(xué) 體育學(xué)院，山西 太原030006；2.魯東大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山東 煙臺(tái)264025；3.煙臺(tái)大學(xué) 體育學(xué)院，山東 煙臺(tái)264005）

間歇訓(xùn)練特別是高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)對(duì)人體肌肉、心臟等器官都形成較大刺激，可顯著增強(qiáng)心臟泵血功能、引起心臟生理性肥大（Ito et al.,2016），但同時(shí)又有引起心肌缺血、心肌纖維化等病理過(guò)程的潛在風(fēng)險(xiǎn)（饒志堅(jiān) 等,2016；王林佳 等,2016）。隨著表觀遺傳學(xué)的不斷發(fā)展，有研究發(fā)現(xiàn)，微小核糖核酸（microRNA，miRNA）可通過(guò)調(diào)控其靶基因表達(dá)而參與調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生理過(guò)程（錢帥偉 等,2014）。因此，可從間歇訓(xùn)練誘導(dǎo)miRNA及其靶基因表達(dá)變化的視角，研究間歇訓(xùn)練導(dǎo)致心臟重塑的可能調(diào)控通路。

miRNA 是一類廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)的小分子非編碼RNA，長(zhǎng)度約為18～25 個(gè)核苷酸，主要通過(guò)轉(zhuǎn)錄后水平的負(fù)性調(diào)控，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用（賈明學(xué) 等,2013）。已有研究表明，不同運(yùn)動(dòng)方式、強(qiáng)度和時(shí)間可引起心臟miRNA 的應(yīng)答，影響基因表達(dá)和蛋白質(zhì)的翻譯，進(jìn)而影響心臟功能，目前已證實(shí)有miR-1、miR-21、miR-24、miR-29、miR-133、miR-155、miR-146a、miR-208、miR-350、miR-30c 等參與運(yùn)動(dòng)心臟的重塑過(guò)程（饒志堅(jiān) 等,2017a,2017b；王世強(qiáng) 等,2017；翟帥 等,2014；張振輝 等,2012；趙永才,2012），但以往研究結(jié)果傾向于對(duì)心臟功能的“良性”影響，而對(duì)“風(fēng)險(xiǎn)”miRNA 的客觀研究和闡釋不足。心臟功能的維持是眾多呈現(xiàn)空間特異性與高度時(shí)效性表達(dá)的基因共同參與的結(jié)果，不同功能的基因共同組成一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中必然有許多能夠響應(yīng)間歇訓(xùn)練的miRNA參與對(duì)這些基因的調(diào)控。那么，除了目前發(fā)現(xiàn)的幾種miRNA，心臟還有哪些能夠響應(yīng)間歇訓(xùn)練的運(yùn)動(dòng)刺激？參與調(diào)控的特異性miRNA 及其靶基因分別有什么作用？這些miRNA 調(diào)控其靶基因的機(jī)制為何？隨著運(yùn)動(dòng)分子生物學(xué)的深入研究，這些問(wèn)題將是今后研究的焦點(diǎn)問(wèn)題。本研究旨在鑒定大鼠心臟中響應(yīng)高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)而差異表達(dá)的miRNA，并根據(jù)miRNA 與其靶基因的表達(dá)譜，解釋大鼠心臟響應(yīng)高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)的基因表達(dá)調(diào)控通路。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象與分組

選取健康雄性Wistar 大鼠20 只，隨機(jī)分為2 組，對(duì)照（control check，CK）組10 只，高強(qiáng)度間歇游泳訓(xùn)練（high- intensity intermittent swimming training，HIST）組10 只。室溫20℃～25℃，濕度45%～60%，光照時(shí)間14 h/天。動(dòng)物經(jīng)3 天時(shí)間適應(yīng)環(huán)境后開(kāi)始建模訓(xùn)練。

1.2 訓(xùn)練模型建立

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，有訓(xùn)練大鼠對(duì)一次高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)的應(yīng)激反應(yīng)程度雖不如安靜大鼠表現(xiàn)強(qiáng)烈，但同樣能夠反映一次HIST 的應(yīng)激生理反應(yīng)，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性明顯好于安靜大鼠，數(shù)據(jù)離散程度更低，可靠性更高，因此，本研究選擇有訓(xùn)練大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象（張瑞萍 等,2011）。

根據(jù)Mcardle（1967）、Voltarelli（2002）的理論，參考徐玉林（1999）、嚴(yán)翊（2006）的研究方法，建立大鼠HIST 模型（張瑞萍 等,2011）。游泳條件：塑鋼玻璃游泳池，長(zhǎng)×寬×高為150×60×70 cm；泳池內(nèi)水深為大鼠身體長(zhǎng)度的2 倍，約60 cm；水溫33℃～36℃。適應(yīng)性游泳3 天，每天1 次，每次持續(xù)時(shí)間依次為第1 天15 min、第2天20 min、第3 天30 min，剔除不擅游泳者。隨后開(kāi)始正式間歇負(fù)重游泳訓(xùn)練，每周連續(xù)訓(xùn)練6 天，第7 天休息，共訓(xùn)練6 周。運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度為尾部負(fù)重體重的5%，游泳持續(xù)6 min，休息4 min，每天連續(xù)進(jìn)行10 輪；游泳期間觀察記錄大鼠的運(yùn)動(dòng)能力及活動(dòng)狀態(tài)，當(dāng)大鼠浮在水面不運(yùn)動(dòng)時(shí)用木棒驅(qū)趕使其維持運(yùn)動(dòng)，當(dāng)大鼠下沉水下無(wú)能力浮上時(shí)立刻托起減少負(fù)重至3%；訓(xùn)練結(jié)束后吹干毛發(fā)，放回鼠籠。

為判斷模型是否建立成功，在第1 周第1 天訓(xùn)練前、第 1 天每 1 輪次后分別測(cè)量大鼠血乳酸（德國(guó) EKF Lactate-Scout 血乳酸儀），依次標(biāo)記為安靜值、變化值1、變化值2、……、變化值10。CK 組不做任何運(yùn)動(dòng)，常規(guī)飼養(yǎng)，自由活動(dòng)。

1.3 動(dòng)物取材

第6 周第6 天HIST 組、CK 組均進(jìn)行間歇負(fù)重游泳訓(xùn)練，結(jié)束后即刻進(jìn)行動(dòng)物取材。兩組大鼠立即同時(shí)注射麻醉，并斷頸處死，解剖出心臟左心室肌，立即放入液氮中冷凍。最后保存于-80℃冰箱中備用。

1.4 miRNA 分離與文庫(kù)構(gòu)建

在液氮中將每只大鼠左心室肌樣品研磨成粉末，并用TRIzol 試劑（Invitrogen 公司）提取總RNA，將各RNA 樣品按組等量混合成2 個(gè)RNA 樣品池：HIST 組RNA 樣品池與CK 組RNA 樣品池。通過(guò)15%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳從各RNA 樣品池中分別分離純化出16～30 nt 的小RNA（sRNA）。然后用T4 RNA 連接酶在每個(gè)小RNA 的5'段和3'端加上接頭，用SuperScript Ⅱ反轉(zhuǎn)錄酶（Invitrogen 公司）將其合成為cDNA，再經(jīng)過(guò)RT-PCR 擴(kuò)增獲得雙鏈cDNA。經(jīng)10%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、回收及純化后的cDNA 用于構(gòu)建sRNA 測(cè)序文庫(kù)。采用NEB Next Ultra small RNA Sample Library Prep Kit for Illumina 試劑盒構(gòu)建sRNA 測(cè)序文庫(kù)。最后由北京百邁客生物公司在Illumina HiSeq2500 測(cè)序儀上進(jìn)行高通量測(cè)序分析。

1.5 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的預(yù)處理

在高通量測(cè)序原始數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，對(duì)其進(jìn)行如下過(guò)濾處理：1）將低質(zhì)量序列去掉；2）去除包含未知堿基的reads；3）去除沒(méi)有3'接頭序列的reads；4）剪切掉3'接頭序列；5）去除短于18 nt 或長(zhǎng)于30 nt 的序列。經(jīng)過(guò)濾處理后，獲得長(zhǎng)度為18～30 nt 的高質(zhì)量的clean reads。然后，再通過(guò)對(duì)Rfam 和GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相似性搜索，過(guò)濾掉可能是mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、srpRNA 和scRNA 等的序列。

1.6 已知miRNA 的鑒定

運(yùn)用BLAST 程序，將過(guò)濾后剩余的sRNA 序列與miRBase 數(shù)據(jù)庫(kù)搜索比對(duì)，凡是能與數(shù)據(jù)庫(kù)中已儲(chǔ)存動(dòng)物物種的已知miRNA 匹配的sRNA 序列，就可以將其看作是一個(gè)已知miRNA。

1.7 預(yù)測(cè)新的候選miRNA

運(yùn)用Soap 程序?qū)⑹Ｓ辔醋⑨尩膕RNA 序列與大鼠基因組序列進(jìn)行比對(duì)，挑選出能與大鼠基因組序列完美匹配的sRNA 序列。然后，利用miRNA 預(yù)測(cè)軟件MIREAP 從中預(yù)測(cè)出新的候選miRNA（novel miRNA）。

1.8 miRNA 差異表達(dá)分析

基于sRNA 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，計(jì)算出每個(gè)miRNA 的表達(dá)量。首先將兩組大鼠各自miRNA 的表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，然后對(duì)這兩組間的miRNA 進(jìn)行差異表達(dá)分析。使用|log2（FC）|≥1 且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）≤0.01 作為差異表達(dá)的篩選標(biāo)準(zhǔn)（Jiang et al.,2018），其中，以差異倍數(shù)（Fold Change，F(xiàn)C）表示兩組間表達(dá)量的比值，即HIST 組表達(dá)量與CK 組表達(dá)量之間的比值。若log2（FC）≥1，則表示miRNA表達(dá)上調(diào)；若log2（FC）≤-1，則表示miRNA 表達(dá)下調(diào)。

1.9 miRNA 靶基因預(yù)測(cè)及功能富集分析

針對(duì)差異表達(dá)miRNA，運(yùn)用miRNA 靶基因預(yù)測(cè)軟件miRanda、RNAhybrid 和TargetScan 從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中大鼠基因?qū)?yīng)的cDNA 序列中預(yù)測(cè)出miRNA 對(duì)應(yīng)的靶基因。這里使用大鼠基因?qū)?yīng)的cDNA 序列來(lái)自：（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/gene/DATA/GENE_INFO/Mammalia/Rattus_norvegicus.gen e_info）。然后，對(duì)miRNA 靶基因進(jìn)行功能注釋，對(duì)其進(jìn)行GO 與KEGG 分析，進(jìn)而預(yù)測(cè)出miRNA 可能的調(diào)控功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 建模情況

第1 周第1 天測(cè)得血乳酸安靜值（6.79±1.41 mmol/L），血乳酸變化值隨輪次增加逐漸遞增且變化值均大于安靜值，根據(jù)Voltarelli（2002）的理論，符合高強(qiáng)度間歇游泳運(yùn)動(dòng)的模型標(biāo)準(zhǔn)，模型建立成功。訓(xùn)練期間第1 周出現(xiàn)第8～10 輪次訓(xùn)練時(shí)部分大鼠不能堅(jiān)持的情況（累計(jì)13 鼠·輪次），作減重至3%處理后完成訓(xùn)練，之后訓(xùn)練過(guò)程中所有大鼠均能堅(jiān)持做完負(fù)重5%體重的間歇訓(xùn)練，建模達(dá)到預(yù)期效果。

2.2 miRNA 高通測(cè)序數(shù)據(jù)預(yù)處理與分析

經(jīng)高通量測(cè)序，CK 組大鼠獲得15 499 132 條測(cè)序原始數(shù)據(jù)（raw reads），HIST 組獲得15 803 934 條raw reads。經(jīng)過(guò)濾處理后，各自分別得到13 864 049（CK 組）和14 460 159（HIST 組）條過(guò)濾后得到的Reads 數(shù)據(jù)（clean reads）（表1）。其中，CK 組有8 901 163（64.2%）條reads 被定位（mapped）到大鼠基因組上，HIST 組有8 904 502（61.58%）條reads 被定位到大鼠基因組上。

表1 sRNA 高通測(cè)序數(shù)據(jù)的概括統(tǒng)計(jì)Table 1 Summary Statistics of Small RNA Deep Sequencing

對(duì)過(guò)濾處理后的clean reads 進(jìn)行長(zhǎng)度分布分析，發(fā)現(xiàn)90%以上reads 長(zhǎng)度集中在20～24 nt 之間，其中長(zhǎng)度為22 nt 的read 最多，約占到了總clean reads 的一半（圖1）。由此可見(jiàn)，測(cè)序得到的sRNA 序列的長(zhǎng)度分布趨勢(shì)與動(dòng)物中成熟miRNA 的長(zhǎng)度分布是一致的。

圖1 不同長(zhǎng)度的cleans reads 分布圖Figure 1.The Distribution of Cleans Reads with Different Length

圖2 兩組大鼠組間共有及特有sRNA 的種類、數(shù)量韋恩圖Figure 2.Wayne Diagram of Common and Specific Reads of Uniq_sRNA and Total_sRNA between Groups

兩組大鼠中共有和特有的sRNA 種類（uniq_sRNA）和數(shù)量（total_sRNA）（圖2）。兩組共有的uniq_sRNA 是15.48%，共有的total_sRNA 是97.02%，這說(shuō)明，二者共有的sRNA 表達(dá)量很高。

在clean reads（sRNA）中，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索比對(duì)，去除非miRNA 的序列（如mRNA，rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA，srpRNA，scRNA，repeat-associated elements 等）后，CK 組與HIST 組分別得到了13 135 777 條和13 429 514條未被注釋的序列（表2）。

表2 兩組大鼠文庫(kù)中各種sRNA 的分布Table 2 Classification/Annotation of Small RNAs in Two Groups' Libraries

2.3 大鼠心臟已知miRNA 識(shí)別與新miRNA 預(yù)測(cè)

所有樣品共鑒定出868 個(gè)miRNA，其中，已知miRNA 531 個(gè)，新預(yù)測(cè)miRNA337 個(gè)（表3）。

2.3.1 已知miRNA 的識(shí)別

通過(guò)比對(duì)miRBase 數(shù)據(jù)，兩組大鼠共找出531 個(gè)已知miRNA，CK 組找到495 個(gè)已知miRNA，HIST 組找到498個(gè)已知miRNA。其中，兩組共有的已知miRNA 有462個(gè)，CK 組特有的為33 個(gè)，HIST 組特有的為36 個(gè)。兩組中表達(dá)最多的10 個(gè)已知miRNA 信息如表4所示。

表3 兩組大鼠miRNA 概括統(tǒng)計(jì)Table 3 Summary Statistics of miRNAs in Two Groups' Libraries/n

表4 兩組大鼠表達(dá)最多的已知miRNATable 4 The Most Abundant Known miRNAs Obtained from Two Groups' Libraries

2.3.2 新miRNA 預(yù)測(cè)

采用miRNA 預(yù)測(cè)軟件MIREAP，兩組共預(yù)測(cè)出337 個(gè)新的miRNA，CK 組預(yù)測(cè)出288 個(gè)新miRNA，HIST 組預(yù)測(cè)出288 個(gè)新miRNA。其中，兩組共有的新miRNA 有239個(gè)，CK 組特有的為49 個(gè)，HIST 組特有的為49 個(gè)。新miRNA 的首位堿基偏向于U，長(zhǎng)度分布在18～25 nt，其中以22 nt 為主，這些特征均與目前大鼠中已知序列特征相符。根據(jù)目前miRNA 的命名規(guī)則并參考不同物種的習(xí)慣命名法，本研究對(duì)新預(yù)測(cè)的miRNA 進(jìn)行了命名，分別被命名為rno-miR-n001 到rno-miR-n337。兩組中表達(dá)最多的10個(gè)新miRNA 信息如表5所示。

2.4 miRNA 差異表達(dá)分析

通過(guò)差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，HIST 組與CK 組大鼠之間大多數(shù)miRNA 的表達(dá)無(wú)顯著差異，但也發(fā)現(xiàn)32 個(gè)miRNA 存在顯著的差異表達(dá)（圖3、表6）。與CK 組大鼠相比，HIST 組顯著上調(diào)表達(dá)的miRNA 共22 個(gè)，顯著下調(diào)表達(dá)的miRNA 共10 個(gè)。這證實(shí)了高強(qiáng)度間歇游泳運(yùn)動(dòng)能誘導(dǎo)大鼠心肌中miRNA 發(fā)生顯著的差異表達(dá)。其中，rno-miRn106 只在CK 組中表達(dá)，而在HIST 組中沒(méi)有檢測(cè)到其表達(dá)。有7 個(gè)miRNA 的表達(dá)FC 達(dá)到了4 倍以上（|log2（FC）|≥2），分別是miR-212-3p、miR-132-5p、rnomiR-n150、miR-212-5p、rno-miR-n117、miR-122-5p、rno-miR-n106。由此可見(jiàn)，高強(qiáng)度間歇游泳運(yùn)動(dòng)確實(shí)能夠誘導(dǎo)心臟中miRNA 的差異表達(dá)。

2.5 差異表達(dá)miRNA 靶基因預(yù)測(cè)及其功能分析

2.5.1 靶基因預(yù)測(cè)

在所有32 個(gè)響應(yīng)高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)的差異表達(dá)miRNA中，有25 個(gè)miRNA 共預(yù)測(cè)出1 197 個(gè)靶基因，平均每個(gè)miRNA 有47.88 個(gè)靶基因；其他的7 個(gè)差異表達(dá)miRNA 未能預(yù)測(cè)到對(duì)應(yīng)的靶基因。除miR-124-3p、miR-200a-5p 僅預(yù)測(cè)到1 個(gè)靶基因外，其余miRNA 均能同時(shí)預(yù)測(cè)到多個(gè)靶基因，且存在不同miRNA 靶向同一編碼基因的情況，例如，miR-503-3p 和miR-6315 都能調(diào)控Tet3，miR-132-5p和miR-503-3p 都能調(diào)控Pyroxd2。由此可見(jiàn)，差異表達(dá)miRNA 可能參與了眾多基因的表達(dá)調(diào)控。

2.5.2 靶基因功能注釋

通過(guò)對(duì)miRNA 靶基因進(jìn)行功能注釋，發(fā)現(xiàn)靶基因及其編碼蛋白參與心臟多種生理功能的調(diào)控。這些靶基因包括涉及心肌細(xì)胞增殖、分化（如Tenm4、Rxrb、Rbp4、Prickle1、Foxs1），心肌凋亡（如Ltk），心肌發(fā)育和形態(tài)發(fā)生（如Epo、Foxs1、Actl10、Epor、Gja1、Srf、Camk2a），心肌收縮（如Srf、Camk2a），心肌肥厚調(diào)節(jié)（如Akap13），心臟傳導(dǎo)（如Gja1），轉(zhuǎn)錄調(diào)控（如Rxrb、Rbp4、Prickle1、Epo、Foxs1、Srf）（表7）。

為了進(jìn)一步分析差異表達(dá)miRNA 靶基因功能，本研究對(duì)這些靶基因進(jìn)行了GO 分析與KEGG 分析。組間差異表達(dá)miRNA 靶基因GO 注釋結(jié)果表明，差異表達(dá)的miRNA所對(duì)應(yīng)的靶基因主要涉及的生物學(xué)過(guò)程包括細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝、應(yīng)激、調(diào)節(jié)、免疫、細(xì)胞生理等、細(xì)胞組分包括細(xì)胞膜、細(xì)胞器和細(xì)胞外基質(zhì)等；生物分子功能包括催化活性、轉(zhuǎn)運(yùn)活性、酶調(diào)節(jié)活性及結(jié)合活性等（圖4）。

組間差異表達(dá)miRNA 靶基因的KEGG 注釋結(jié)果如圖5所示，發(fā)現(xiàn)其參與腎素-血管緊張素系統(tǒng)、MAPK 通路、Hippo 通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路、PPAR 信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路、p53 信號(hào)通路、病毒性心肌炎炎癥通路、cGMP-PKG 信號(hào)通路、mRNA 監(jiān)控通路等多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

KEGG 通路的富集分析結(jié)果如圖6所示，研究發(fā)現(xiàn)，這些靶基因在病毒性心肌炎炎癥通路、cGMP-PKG 通路的富集水平明顯高于其他通路，這說(shuō)明，參與病毒性心肌炎炎癥通路與cGMP-PKG 通路的靶基因最多。

圖4 靶基因GO 注釋圖Figure 4.GO Annotation of Target Genes

圖5 靶基因KEGG 分類圖Figure 5.KEGG Classification Diagram of Target Genes

圖6 靶基因KEGG 通路富集散點(diǎn)圖Figure 6.KEGG Enrichment Scatter Plot of Target Genes

3 討論

間歇訓(xùn)練法起源于20世紀(jì)初，并由德國(guó)生理學(xué)家Hans Reindell 和教練員Woldemar Gerschler 于20世紀(jì)40年代正式提出，因其具有顯著增強(qiáng)心泵功能的作用，長(zhǎng)期廣泛應(yīng)用于運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練領(lǐng)域（鄧樹(shù)勛,1990；黎涌明,2015；劉瑞東 等,2017）。關(guān)于間歇訓(xùn)練增強(qiáng)心泵功能的機(jī)制研究，國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要集中于抑制心肌凋亡、促進(jìn)心肌代謝、增強(qiáng)心肌肌原纖維收縮等方面，研究方法主要有心功能評(píng)定、代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)檢測(cè)及其基因表達(dá)分析等（董蕾,2012；李麗 等,2017；田振軍 等,2015）。miRNA 是一種可以調(diào)控基因表達(dá)的小分子非編碼核糖核酸，從心肌miRNA 的視角探究間歇訓(xùn)練對(duì)心臟基因表達(dá)的影響，具有重要的研究?jī)r(jià)值。

3.1 高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)心臟miRNA 產(chǎn)生的不同調(diào)控趨向

3.1.1 上調(diào)表達(dá)的心肌miRNA

本研究根據(jù)miRNA 整體表達(dá)情況以及兩組間的變化特征，對(duì)差異表達(dá)miRNA 進(jìn)行后續(xù)分析。在篩選出的22 個(gè)上調(diào)表達(dá)miRNA 中，多數(shù)已有相關(guān)研究報(bào)道，如韓志華（2014）發(fā)現(xiàn)，miR-27a 通過(guò)SMAD-Akt-mTOR 通路誘導(dǎo)缺血心肌自噬，抑制細(xì)胞凋亡，減輕心肌細(xì)胞損傷，保護(hù)細(xì)胞功能。Eskildsen 等（2015）發(fā)現(xiàn)，心臟肥大、心力衰竭會(huì)促使miR-132、miR-212 上調(diào)，miR-132 在房顫的發(fā)生中也出現(xiàn)上調(diào)的趨勢(shì)（Qiao et al.,2017）。Wang 等（2016）發(fā)現(xiàn)，miR-134-5p 在急性心力衰竭早期顯著增加。張?jiān)诒＃?013）發(fā)現(xiàn)，2 型糖尿病大鼠心肌梗死后缺血區(qū)miR-503 表達(dá)上調(diào)。Díaz 等（2017）發(fā)現(xiàn)，miR-125a-3p 在心肌缺血細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。有些篩出的miRNA 雖無(wú)相關(guān)報(bào)道證實(shí)其在心肌細(xì)胞中的調(diào)控作用，但在循環(huán)血液miRNA 的研究中發(fā)現(xiàn)了它們對(duì)心臟功能的作用，如Kinno 等（2014）發(fā)現(xiàn)循環(huán)miR-411、miR-409 在房顫的發(fā)生中表達(dá)上調(diào)；Harling 等（2017）發(fā)現(xiàn)在術(shù)后房顫患者血清中miR-483-5p 過(guò)度表達(dá)。這些研究印證了本研究的預(yù)測(cè)結(jié)果，也提示了這些差異表達(dá)miRNA 在響應(yīng)間歇運(yùn)動(dòng)中的作用，既有可能使心臟發(fā)生缺血心肌自噬的保護(hù)機(jī)制，也存在心力衰竭、心肌缺血、心律失常（如房顫）等可能的變化過(guò)程。

3.1.2 下調(diào)表達(dá)的心肌miRNA

與CK 組大鼠相比，有10 個(gè)miRNA 在HIST 組表現(xiàn)出下調(diào)趨勢(shì)，其中的多數(shù)miRNA 也已有相關(guān)研究報(bào)道，如Xu 等（2016）發(fā)現(xiàn)，miR-429 下調(diào)可引起Notch1 表達(dá)增加，進(jìn)而達(dá)到保護(hù)心肌細(xì)胞免于缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；Soci 等（2016）發(fā)現(xiàn)高強(qiáng)度游泳運(yùn)動(dòng)可使miR-208b 下調(diào)，誘導(dǎo)心肌生理性肥大。Liu 等（2016）、Dias 等（2016）發(fā)現(xiàn)，在心肌梗死引起的心力衰竭大鼠心臟中，miR-122-5p表達(dá)上調(diào)，提示miR-122-5p 有促心肌細(xì)胞凋亡的作用。Li等（2016）發(fā)現(xiàn)，miR-182 可通過(guò)Akt-mTOR-p70S6K 通路，抑制 Bcat2 表達(dá)，誘導(dǎo)心肌病理性肥大的發(fā)生；Cakmak 等（2015）發(fā)現(xiàn)，充血性心力衰竭與miR-182 的上調(diào)表達(dá)有關(guān)；Wang 等（2018）發(fā)現(xiàn)，衰老大鼠出現(xiàn)心臟舒張功能下降、心肌纖維化、自發(fā)性高血壓等表現(xiàn)，這可能與miR-182、miR-208b-3p 的上調(diào)有關(guān)系。劉長(zhǎng)召等（2017）發(fā)現(xiàn)，miR-200b-3p 可能通過(guò)調(diào)控FSTL1 的表達(dá)而參與心肌細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等過(guò)程，誘導(dǎo)心肌梗死的出現(xiàn)。Yvan 等（2017）發(fā)現(xiàn)，循環(huán)miR-124-3p 的上調(diào)與心臟驟停的發(fā)生有關(guān)。前人的研究提示，這些miRNA 響應(yīng)高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)而出現(xiàn)的下調(diào)表達(dá)對(duì)于抑制心肌凋亡、抑制心力衰竭、抑制心肌纖維化、誘導(dǎo)心肌生理性肥大、維持心臟正常功能具有重要意義，在HIST 導(dǎo)致的心臟重塑中起到“良性”作用。

而其他下調(diào)表達(dá)的miRNA 被驗(yàn)證具有相反的作用，如Yao 等（2017）發(fā)現(xiàn)，miR-183-5p 上調(diào)表達(dá)可阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和心力衰竭；Yang 等（2018）發(fā)現(xiàn)，miR-200a-5p 可通過(guò)靶向RNF11 阻斷心肌細(xì)胞凋亡；Fang等（2015）發(fā)現(xiàn)，肥厚型心肌病患者（HCM）的彌漫性心肌纖維化的發(fā)生伴隨循環(huán)miR-96-5p 的下調(diào)表達(dá)。上述研究提示，這些miRNA 在HIST 組心肌中的下調(diào)表達(dá)增加了心肌凋亡、心肌纖維化、心力衰竭的可能性，在HIST 導(dǎo)致的心臟重塑中起著“風(fēng)險(xiǎn)”作用。

綜上，這些下調(diào)表達(dá)的miRNAs 也在心臟響應(yīng)間歇運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮不同的作用，既有誘導(dǎo)心肌生理性肥大、抑制心肌凋亡、保護(hù)心肌細(xì)胞的作用，又有誘發(fā)心力衰竭、心肌纖維化和心肌凋亡的風(fēng)險(xiǎn)。

根據(jù)上調(diào)、下調(diào)miRNA 及其前人研究證據(jù)，可以推測(cè)在高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致心臟重塑的過(guò)程中，miRNA 對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控可表現(xiàn)出多向性，既可能向心臟生理性肥大、保護(hù)心肌等良性方向發(fā)展，也可能演變?yōu)樾牧λソ?、心肌缺血、心肌纖維化、心肌凋亡、心律失常等惡性的病理過(guò)程（表8），而不同miRNA 的表達(dá)會(huì)影響其向不同的方向發(fā)展，心肌重塑的最終發(fā)展方向，受多種miRNA 共同作用的影響。這種眾多miRNA 共同調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)制，有待于進(jìn)一步研究。而miR-6315、miR-6324、miR-664-2-5p、miR-191a-3p 等是否與運(yùn)動(dòng)心臟重塑或病理性心臟重塑有關(guān)尚未見(jiàn)報(bào)道，后續(xù)可進(jìn)一步進(jìn)行這部分研究。

3.2 miRNA 通過(guò)對(duì)靶基因調(diào)控實(shí)現(xiàn)對(duì)心臟生理活動(dòng)的影響

miRNA 通過(guò)調(diào)控靶基因發(fā)揮作用，因此，本研究對(duì)差異表達(dá)的miRNA 進(jìn)行了靶基因注釋，并與以前報(bào)道的參與運(yùn)動(dòng)響應(yīng)的基因進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)，間歇游泳運(yùn)動(dòng)響應(yīng)的miRNA 可通過(guò)調(diào)控不同的靶基因介入心肌細(xì)胞多種生理生化過(guò)程，包括涉及心肌細(xì)胞增殖與分化、心肌收縮、心肌發(fā)育與形態(tài)發(fā)生、心肌凋亡、心臟傳導(dǎo)和心肌細(xì)胞膜電位變化等。更重要的是，還有一些靶基因可以調(diào)控轉(zhuǎn)錄過(guò)程，如Rxrb、Rbp4、Prickle1、Epo、Foxs1、Srf。值得一提的是，目前雖鮮有關(guān)于miR-6315、miR-6324 以及新預(yù)測(cè) rno-miR-n106、rno-miR-n019、rno-miR-n096、rnomiR-n096 調(diào)控心臟功能的相關(guān)文獻(xiàn)，但其靶基因Epo、Epor、Akap13、Gja1、Ltk、Srf、Camk2a 等對(duì)心肌功能的影響已得到實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。如王小雯（2009）發(fā)現(xiàn)，Epo 及其受體Epor 對(duì)急性心肌梗死大鼠心肌具有保護(hù)作用；Johnson 等（2015）發(fā)現(xiàn)，Akap13 通過(guò)Akap13-PKD1 信號(hào)途徑調(diào)控心肌收縮、細(xì)胞凋亡和代謝通路的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，進(jìn)而誘導(dǎo)心肌代償性肥大；初霞（2010）發(fā)現(xiàn)，Gja1 及其靶蛋白的下調(diào)可誘導(dǎo)心律失常的出現(xiàn)；Honda 等（1999）發(fā)現(xiàn)，心臟中Ltk 的激活可導(dǎo)致心臟肥大、心肌細(xì)胞變性；Shan 等（2010）發(fā)現(xiàn)，Srf 參與了miR-1、miR-206 在糖尿病型心臟病心肌中上調(diào)表達(dá)，引起心肌凋亡的過(guò)程；Guilbert 等（2015）發(fā)現(xiàn)，Camk2a 及其編碼蛋白參與了心肌舒張的調(diào)控過(guò)程。與以往報(bào)道的參與運(yùn)動(dòng)響應(yīng)的miRNA 一致的是，響應(yīng)間歇運(yùn)動(dòng)的心臟miRNA 靶基因也主要涉及心肌生長(zhǎng)、增殖、凋亡、收縮等生理過(guò)程，但本研究發(fā)現(xiàn)，有些靶基因還與心臟傳導(dǎo)、膜電位變化以及轉(zhuǎn)錄的調(diào)控有關(guān)，另外，差異表達(dá)miRNA 與其靶基因之間還存在著“一對(duì)多”“多對(duì)一”的不同的調(diào)控關(guān)系，這些都說(shuō)明，miRNA 影響心臟功能的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制可能非常復(fù)雜。不同miRNA交叉調(diào)控不同基因表達(dá)的機(jī)制，是miRNA 研究的一個(gè)重要方向。

表8 心臟miRNA 響應(yīng)高強(qiáng)度間歇游泳運(yùn)動(dòng)的作用類型Table 8 Types of Cardiac miRNAs Response to HIST

3.3 心臟響應(yīng)高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)的調(diào)控通路分析

通過(guò)對(duì)差異表達(dá)miRNA 的靶基因進(jìn)行GO 分析發(fā)現(xiàn)，這些基因涉及細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝、應(yīng)激、調(diào)節(jié)、免疫、細(xì)胞生理、細(xì)胞膜、細(xì)胞器和細(xì)胞外基質(zhì)、催化活性、轉(zhuǎn)運(yùn)活性、酶調(diào)節(jié)活性及結(jié)合活性等，幾乎涉及心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的各個(gè)方面。

心臟響應(yīng)高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)有賴于miRNA 的靶基因及其編碼蛋白對(duì)多種代謝通路的激活或抑制，實(shí)現(xiàn)對(duì)心臟廣泛功能的調(diào)控。通過(guò)對(duì)KEGG 的注釋結(jié)果進(jìn)行分類后發(fā)現(xiàn)，靶基因參與多條代謝通路，其中包括已有文獻(xiàn)報(bào)道的與運(yùn)動(dòng)心臟重塑密切相關(guān)的腎素-血管緊張素系統(tǒng)、MAPK 通路、Hippo 通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路、PPAR 信號(hào)通路、AMPK 信號(hào)通路、胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路、p53 信號(hào)通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路、cGMP-PKG 信號(hào)通路以及病毒性心肌炎炎癥通路等，這些通路分別涉及細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、心肌纖維化、心臟血管再生、細(xì)胞增殖、心肌細(xì)胞肥大等生理過(guò)程（劉明 等,2012；馬繼政 等,2010；馬智超,2013；徐同毅,2014；趙永才,2012；Gabriel et al.,2016；Ito et al.,2016；Li et al.,2016；Ma et al.,2015；Santos et al.,2016；Xu et al.,2016；Zhao et al.,2016）。其中，病毒性心肌炎炎癥通路、cGMP-PKG 通路是本研究中發(fā)現(xiàn)的富集程度最高的兩個(gè)通路。以上多數(shù)通路在心臟重塑方面的作用機(jī)制已被前人研究所揭示，為本研究解釋HIST 引起心臟miRNA 差異表達(dá)的可能調(diào)控通路提供了重要參考（表9）。

表9 心臟miRNA 響應(yīng)高強(qiáng)度間歇游泳運(yùn)動(dòng)的變化Table 9 Changes of Cardiac miRNAs Response to HIST

該結(jié)果還提示了一些其他的代謝通路，如mRNA 監(jiān)控通路等，雖然目前鮮有相關(guān)研究證實(shí)這些信號(hào)通路與運(yùn)動(dòng)心臟重塑有直接關(guān)聯(lián)，但本研究提示，某些差異表達(dá)的miRNA 可能通過(guò)這些通路參與心臟miRNA 對(duì)間歇運(yùn)動(dòng)的遺傳應(yīng)答過(guò)程。將miRNA 及其靶基因差異表達(dá)情況與心肌生理功能變化結(jié)合起來(lái)，可以更好地揭示心臟響應(yīng)高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)的生理機(jī)制。

4 結(jié)論

高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致大鼠心肌miRNA 出現(xiàn)顯著性差異表達(dá)，影響心肌增殖、凋亡、收縮、心臟傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄等多種生理功能，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)運(yùn)動(dòng)心臟重塑的調(diào)控作用；差異表達(dá)miRNA 與其靶基因之間存在著復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，并且這種調(diào)控作用既有良性的，也有致病性的；這些miRNA 通過(guò)靶基因及其編碼蛋白參與PI3K-Akt 通路、mTOR 通路、MAPK 通路、VEGF 通路以及炎癥反應(yīng)相關(guān)通路等多種信號(hào)通路的調(diào)控，可作為心臟響應(yīng)間歇運(yùn)動(dòng)的生物標(biāo)志物，進(jìn)一步鑒定、驗(yàn)證其功能，可以為間歇訓(xùn)練計(jì)劃的優(yōu)化和運(yùn)動(dòng)風(fēng)險(xiǎn)的監(jiān)測(cè)提供重要參考，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。