高效的西瓜CRISPR/cas9基因敲除技術(shù)

田守蔚 姜臨建 高嬙 張潔 宗梅 張海英 任毅 郭紹貴 宮國義 劉凡 許勇

目的與意義：基因編輯技術(shù)在植物基因功能鑒定以及重要農(nóng)藝性狀突變獲得方面具有重要應(yīng)用價值。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)已應(yīng)用于許多植物物種，成功實(shí)現(xiàn)了靶點(diǎn)突變。然而，目前在西瓜上還沒有CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)相關(guān)的研究報道，該技術(shù)能否成功應(yīng)用于西瓜研究及育種仍未可知。以西瓜的ClPDS基因（編碼八氫番茄紅素脫氫酶，突變后植株有明顯白化表型）為靶基因，嘗試建立西瓜CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)體系，以期利用該技術(shù)在西瓜基因組實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)編輯。

材料與方法：以西瓜自交系‘PI179878為供試材料，利用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法測試靶點(diǎn)特異性與效率，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化西瓜子葉建立西瓜穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系，利用酶切、測序等方法檢測突變效率及突變類型。

結(jié)果與分析：（1）靶點(diǎn)選擇與載體構(gòu)建：選擇西瓜PDS基因ClPDS（Cla010898）作為Cas9核酸內(nèi)切酶的靶基因。在第1和第3外顯子分別選擇1個靶點(diǎn)，BanI和XhoI酶切位點(diǎn)分別在這2個靶點(diǎn)預(yù)測的切割位點(diǎn)上，有利于識別突變。每個靶點(diǎn)的sgRNA分別被克隆到以pGreen為骨架的PHSN401載體中，命名為PHSN1和PHSN2，用于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。2個靶點(diǎn)同時被克隆到pCAMBIA為骨架的PHSE401載體中用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的西瓜遺傳轉(zhuǎn)化。（2）CRISPR/Cas9介導(dǎo)西瓜原生質(zhì)體ClPDS突變：利用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染檢測靶點(diǎn)的效率，采用PCR/限制性內(nèi)切酶（PCR/RE）試驗(yàn)檢測靶位點(diǎn)的突變并估計(jì)突變率。PHSN1或PHSN2分別轉(zhuǎn)染到西瓜原生質(zhì)體細(xì)胞中，打靶效率分別為51.6和42.1%。結(jié)果表明，構(gòu)建的CRISPR/Cas9載體可在西瓜細(xì)胞中瞬時表達(dá)，Cas9/sgRNA復(fù)合體可以高效地對這2個靶點(diǎn)進(jìn)行打靶。（3）CRISPR/Cas9介導(dǎo)西瓜植株ClPDS突變：對西瓜進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，共獲得16株轉(zhuǎn)基因植株，這些植株均表現(xiàn)出純的或嵌合的白化表型。限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物表明，這2個靶點(diǎn)在16株轉(zhuǎn)基因株系中均發(fā)生編輯。隨機(jī)選擇純白化株系10、株系14和嵌合白化株系3進(jìn)行PCR和Sanger測序。對于靶點(diǎn)1，株系3是雜合的，株系10和14為嵌合體。對于靶點(diǎn)2，株系3和株系10為單等位基因純合，分別有7 bp的缺失和1個bp的插入。株系14是雜合體，一個等位基因缺失17bp，另一個等位基因缺失5bp（原圖3）。（4）潛在脫靶性分析：PCR產(chǎn)物測序結(jié)果表明，與目的靶點(diǎn)序列相似的潛在靶點(diǎn)未發(fā)生突變，說明sgRNAs介導(dǎo)的CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)對西瓜ClPDS基因的定向突變具有高的特異性。

結(jié)? ? 論：CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)可以通過瞬時轉(zhuǎn)化或穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)行西瓜基因的定點(diǎn)編輯，所獲T0陽性植株含有ClPDS突變并表現(xiàn)出明顯白化表型，表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)在轉(zhuǎn)化株系中具有高的基因編輯效率。CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在單個轉(zhuǎn)化事件中可以實(shí)現(xiàn)多個靶點(diǎn)的高效打靶，并在T0代即有可能獲得純合突變株。CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)將成為西瓜基因功能研究和遺傳改良的有利工具。