乙烯合成酶基因CitACS4突變導致 西瓜雄花完全花同株性型

紀高潔 張潔 張海英 孫宏賀 宮國義 史建廷 田守蔚 郭紹貴 任毅 沈火林 高俊平 許勇

目的與意義：乙烯在葫蘆科作物性別決定過程中起著至關重要的作用，乙烯合成酶基因ACS突變導致黃瓜和甜瓜雄花完全花同株性型產生，然而在西瓜雄花完全花同株性型產生過程中該基因是否具有同樣作用仍不清楚。通過對心皮原基特異表達的西瓜乙烯合成酶基因CitACS4進行基因功能驗證，以期明確西瓜雄花完全花同株性型產生的原因，為西瓜的基因改良提供理論基礎。

材料與方法：利用生物信息學方法鑒定出西瓜的ACS基因。使用聚合酶鏈式反應（PCR）從具有不同性型的25個西瓜種質庫（包含19種雌雄同體，1種雌性系，5種雄花完全花同株）中擴增CitACS4的基因組序列，進行序列比對鑒定與雄花完全花同株性型共分離的SNP，利用該SNP位點開發(fā)dCAPs標記。以雄花完全花同株系AKKZW（aa）和雌雄同株系XHB（AA）雜交構建F2群體。進一步利用酶活性檢測、組織特異性表達分析驗證CitACS4基因在雄花完全花同株性型產生過程中的作用。

結果與分析： （1）同源性和結構分析：在西瓜基因組鑒定得到8個ACS基因，其中CitACS4與甜瓜的CmACS-7基因在氨基酸水平上具有94%的序列一致性。CitACS4基因組全長1 720 bp，包含3個外顯子和2個內含子，編碼具有444個氨基酸的多肽。（2）多態(tài)性位點分析：從具有不同性型的25個西瓜種質庫（包含19種雌雄同體，1種雌性系，5種雄花完全花同株）中擴增了CitACS4的基因組序列。鑒定出G1477C的SNP與雄花完全花同株性型共分離，該突變在殘基364處引起半胱氨酸（C）至色氨酸（W）的替換（命名為C364W）。（3）C364W替換與雄花完全花同株性型的相關性：以雄花完全花同株系AKKZW（aa）和雌雄同株系XHB（AA）之間的雜交構建了F2群體，用于檢測C364W替換是否與雄花完全花同株性型相關。設計dCAPs標記dCAPs_FspBI以檢測G1477C的多態(tài)性。440個F2子代群體的基因型分析顯示，獲得的107株雄花完全花同株性型植物與dCAPs_FspBI的aa基因型共分離，而剩余的333個后代中沒有表現(xiàn)為雄花完全花同株性型，表明a基因與C364W替換密切相關。（4）C364W突變對ACS酶活性的影響：ACS蛋白具有12個保守框，C364W位于保守框6中。ACS酶活檢測分析表明C364W突變降低了CitACS4的酶活性（原圖2-A）。CitACS4的三維建模表明C364殘基位于α-羧酸骨架中。在該模型中，半胱氨酸殘基具有巰基，其可能潛在地形成二硫鍵以維持蛋白質穩(wěn)定性。C364W替換可能破壞了CitACS4的穩(wěn)定性，隨后破壞了酶的活性。（5）CitACS4基因的表達分析：組織特異性表達分析發(fā)現(xiàn)CitACS4在雌花和完全花中特異性表達（原圖2-B）。RNA原位雜交分析顯示，在stage5和stage6，CitACS4在雌性和完全花花蕾的心皮原基中特異性表達（原圖2-C～D），而在雄性花蕾中未檢測到表達（原圖2-E）。CitACS4表達模式與黃瓜CsACS2和甜瓜CmACS-7基因相類似。

結? ? 論： 西瓜中的雄花完全花同株性型是由CitACS4中的隱性突變引起的。CitACS4編碼的乙烯合成酶在雄花完全花同株性型西瓜中的活性受損，這可能使心皮原基中乙烯產生減少進而導致雄花完全花同株性型產生，該結果將來可應用于西瓜育種和遺傳改良。