西瓜種子敗育的胚胎學(xué)觀察

張超越 王迎夏 鄭艷艷 戰(zhàn)佩玉 李帆 劉林

摘? ? 要：西瓜子房產(chǎn)生大量胚珠，但只有部分發(fā)育為成熟種子，其余均在發(fā)育途中敗育，因此用顯微技術(shù)對(duì)西瓜種子敗育進(jìn)行了胚胎學(xué)觀察。結(jié)果表明，開(kāi)花當(dāng)天，部分胚珠缺少胚囊，成為無(wú)胚囊胚珠，這些胚珠沒(méi)有花粉管進(jìn)入;部分含胚囊的胚珠也未有花粉管進(jìn)入，花后1～2 d仍未有花粉管進(jìn)入。授粉后10 d，部分種子無(wú)胚，部分含有球形胚，部分含有心形胚，部分含魚(yú)雷形胚。果實(shí)成熟時(shí)，仍然有部分種子不含胚，部分含球形胚，部分含心形胚，部分含魚(yú)雷胚，約半數(shù)含有成熟胚。顯然，西瓜種子敗育有3種方式：（1）胚珠不產(chǎn)生成熟胚囊;（2）不能實(shí)現(xiàn)受精作用;（3）胚在發(fā)育中途停止發(fā)育。

關(guān)鍵詞：西瓜;種子敗育;胚胎學(xué)

Abstracts： Watermelon produces a large number of ovules，about half of which develop into mature seeds while the rest abort during development. The abortion was examined by means of microscopy. At the flowering day， some ovules lacking embryo sacs were not visited by pollen tubes，and neither were some containing embryo sacs. Pollen tubes were still absent from some embryo sac-containing ovules one or two days after flowering， which underwent degeneration. In the fruits of 10 d after pollination，some seeds lacked embryos， some contained spherical embryos， some contained heart-shaped embryos， and some contained torpedo-shaped embryos. In mature fruits， some lacked embryos， some contained spherical embryos， some contained heart-shaped embryos， some contained torpedo-shaped embryos， and some contained mature embryos. In conclusion， there were three types of abortion： （a） The ovules did not produce mature embryo sacs. （b） No pollen tubes entered the embryo sac-containing ovules for fertilization. （c） The embryos aborted during seed development.

Key words： Watermelon;Seed abortion;Embryology

種子敗育是農(nóng)作物育種工作者非常關(guān)注的問(wèn)題，種子敗育與多種因素有關(guān)，花粉、胚囊、胚及胚乳等發(fā)育過(guò)程的任何一個(gè)不正常都會(huì)導(dǎo)致種子敗育[1]，具體包括以下幾種情況：（1）雄性不育，如花藥退化[2]、花粉敗育[3]和絨氈層發(fā)育不正常[4]。（2）雌性不育，如大孢子母細(xì)胞發(fā)育異常而不能形成胚囊[5]、珠心提早解體[6]。（3）不能實(shí)現(xiàn)受精作用，如花粉與柱頭不親和[7]。（4）胚在發(fā)育中途停止發(fā)育，果實(shí)成熟時(shí)種子的胚為二細(xì)胞原胚、球形胚、心形胚或魚(yú)雷胚[8-10]，引起種胚停止發(fā)育的因素很多，如胚乳發(fā)育不正常[11]、植物激素失去平衡[12]以及營(yíng)養(yǎng)不良等[13]。

西瓜是世界十大水果之一，栽培面積與產(chǎn)量相當(dāng)大[14-16]。西瓜種子通常發(fā)生大量敗育，尤其三倍體和四倍體種子敗育更為嚴(yán)重，成為育種工作中的突出問(wèn)題[17-18]。研究西瓜種子敗育不僅具有理論意義，而且對(duì)解決育種工作中的實(shí)際問(wèn)題具有參考價(jià)值。二倍體西瓜花粉發(fā)育正常，每個(gè)花藥內(nèi)都形成無(wú)數(shù)正常的花粉粒[19-20]，意味著種子敗育的原因不在于花粉。筆者從種胚胚胎學(xué)入手探討種子敗育的機(jī)制，為解決種子敗育問(wèn)題提供參考。

1 材料與方法

以西瓜品種‘京欣為試驗(yàn)材料，種子由臨沂市種子公司提供。3月初播種于營(yíng)養(yǎng)缽，4月移栽于臨沂大學(xué)實(shí)習(xí)基地，沂蒙山區(qū)丘陵地。試驗(yàn)于2017—2018年在臨沂大學(xué)藥用植物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

6月底至7月初從健壯植株上取樣，包括開(kāi)花前的雌花20個(gè)，開(kāi)花當(dāng)天雌花10個(gè)，花后1 d、2 d和3 d的雌花各10個(gè)，授粉后10 d幼果10個(gè)，成熟果實(shí)10個(gè)。對(duì)于花前花蕾，將其子房切成小于1 mm3的小塊;對(duì)于開(kāi)花當(dāng)天及花后3 d的花蕾，從其子房中取出胚珠。將樣品小塊和胚珠先用2% 戊二醛（0.05 mol·L-1 磷酸緩沖液配制，pH 6.8）于常溫下固定 12 h，然后用 1% 四氧化鋨（上述磷酸緩沖液配制）于4oC 溫度下再固定12 h，用10% 梯度的上行系列酒精脫水，Embed-812樹(shù)脂包埋。玻璃刀切片，厚度1.5 μm，甲苯胺藍(lán)O染色，光鏡下觀察胚珠的發(fā)育、開(kāi)花及花后胚珠中胚囊的結(jié)構(gòu)和進(jìn)入珠心的花粉管。

對(duì)于授粉后10 d的幼果以及收獲期的成熟果實(shí)，從中分離出所有種子，首先檢查種子大小和種皮顏色，然后通過(guò)解剖并結(jié)合顯微鏡檢查，分出正常發(fā)育種子和敗育種子，并鏡檢敗育種子中胚的發(fā)育進(jìn)程。

2 結(jié)果與分析

2.1 胚珠發(fā)育

西瓜雌蕊具3心皮，3個(gè)側(cè)膜胎座向內(nèi)突入子房室，在中央會(huì)合，之后向兩側(cè)發(fā)生分支，分支產(chǎn)生翻卷（圖1-A1）。分支末端依次產(chǎn)生5個(gè)胚珠原基（圖1-A1～A2，B1～B2）（圖1-B2），1個(gè)子房共產(chǎn)生1 000多個(gè)胚珠原基。顯然，西瓜子房中的胚珠依次產(chǎn)生，同一時(shí)刻同一子房中的胚珠可能處于不同的發(fā)育階段。

胚珠原基生長(zhǎng)到一定階段，向胎座末端方向稍微彎曲，呈現(xiàn)出背腹，曲線外方為背，曲線內(nèi)方為腹。原基的腹面首先分化出珠心，然后，珠心基部分化出內(nèi)珠被和外珠被。外珠被和內(nèi)珠被明顯不同（圖1-C～E），外珠被具多層細(xì)胞，內(nèi)珠被僅由兩層細(xì)胞構(gòu)成（圖1-E～F），但內(nèi)珠被比外珠被略長(zhǎng)，故內(nèi)珠被從珠孔處突出（圖1-F）。

胚珠生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)生接近180°彎曲，使珠孔與珠柄非常接近，形成倒生胚珠（圖1-F）。大孢子母細(xì)胞與表皮之間有多層珠心細(xì)胞，即西瓜珠心為厚珠心型（圖1-D～G）。

2.2 胚珠敗育

珠心中發(fā)育出大孢子母細(xì)胞（圖1-D～E），母細(xì)胞減數(shù)分裂產(chǎn)生4個(gè)大孢子，其中3個(gè)退化，1個(gè)成為功能大孢子。功能大孢子的細(xì)胞核經(jīng)3次分裂產(chǎn)生8核胚囊，開(kāi)花前胚囊細(xì)胞化，產(chǎn)生1個(gè)卵細(xì)胞、2個(gè)助細(xì)胞、3個(gè)反足細(xì)胞和1個(gè)中央細(xì)胞，但在1個(gè)切面上通常只能觀察到部分胚囊成員（圖1-F～G）。

開(kāi)花當(dāng)天雌蕊中的胚珠大小差異不明顯，但通過(guò)對(duì)大量胚珠連續(xù)切片觀察，發(fā)現(xiàn)胚珠的發(fā)育狀態(tài)卻不同：大多數(shù)胚珠都含有胚囊（圖1-F～G），但也有部分胚珠缺少胚囊（圖1-H1～H4）。缺少胚囊的胚珠，其珠心在花后 2 d就呈現(xiàn)明顯退化、萎縮（圖1-I1～I(xiàn)4，J1～J2）。顯然，缺少胚囊的胚珠很快敗育，不能發(fā)育成種子。缺少胚囊的胚珠位于胎座較前的位置，是發(fā)生較晚的胚珠。

花粉管是輸送精子到達(dá)胚珠以完成受精作用的結(jié)構(gòu)，因此觀察花粉管是否進(jìn)入胚珠，以了解胚珠是否受精。對(duì)開(kāi)花后的胚珠進(jìn)行連續(xù)切片觀察，發(fā)現(xiàn)多數(shù)含有胚囊的胚珠有花粉管進(jìn)入（圖1-K～N），但也有部分含胚囊的胚珠沒(méi)有花粉管進(jìn)入（圖1-O1～O4），缺少胚囊的胚珠全部沒(méi)有花粉管進(jìn)入。有花粉管進(jìn)入的胚珠都是發(fā)生較早的胚珠，沒(méi)有花粉管進(jìn)入的胚珠都是發(fā)生較晚的胚珠。

2.3 種子敗育

受精后，合子進(jìn)行有絲分裂，形成單列細(xì)胞的胚柄和多細(xì)胞的胚本體，在器官分化之前，胚本體呈球形，稱(chēng)球形胚。當(dāng)球形胚分化出子葉原基，胚本體呈心形，為心形胚。子葉原基伸長(zhǎng)，胚本體呈魚(yú)雷形，稱(chēng)魚(yú)雷胚。當(dāng)子葉、胚根等器官完全形成，胚成熟。

坐果10 d的果實(shí)，胎座呈乳白色，此時(shí)，種子大小、顏色以及胚的發(fā)育進(jìn)程明顯不同，可分為以下4種情況：（1）種子長(zhǎng)度1 mm左右，沒(méi)有顏色，缺少胚，胚囊合點(diǎn)端有卵器退化的殘跡（圖1-P1～P3），與開(kāi)花時(shí)含有胚囊但沒(méi)有花粉管進(jìn)入的胚珠相對(duì)應(yīng)。（2）種子長(zhǎng)度2～3 mm（圖1-Q-1號(hào)培養(yǎng)皿），基本沒(méi)有顏色，含有球形胚，這些種子源于發(fā)生較晚的胚珠。（3）種子長(zhǎng)5～7 mm（圖1-Q-2號(hào)培養(yǎng)皿），種皮呈白色，含有心形胚，這些種子源于發(fā)生較晚的胚珠。（4）種子長(zhǎng)8～9 mm（圖1-Q-3號(hào)培養(yǎng)皿），種皮呈淺棕色，含有魚(yú)雷胚，這些種子源于發(fā)生較早的胚珠。

果實(shí)成熟時(shí)胎座呈紅色，種子仍處于不同發(fā)育階段，如圖1所示，可分為4種情況：（1）種子長(zhǎng)1 mm左右（標(biāo)示1），無(wú)色，缺少胚，與座果10 d時(shí)長(zhǎng)度僅1 mm的種子相似，這類(lèi)種子占種子總數(shù)的12.83（±7.06）%。（2）種子長(zhǎng)約3～4 mm（標(biāo)示2），白色至淺棕色，柔軟，含球形胚或心形胚，與座果10天時(shí)長(zhǎng)度2～3 mm的種子相似，這類(lèi)種子占（9.27±1.72）%。（3）種子長(zhǎng)7～8 mm（標(biāo)示3），種皮軟，呈棕色，含魚(yú)雷胚，與座果10 d時(shí)長(zhǎng)度5～7 mm的種子相似，這類(lèi)種子占（29.13±2.79）%。（4）種子長(zhǎng)9～10 mm，種皮硬，呈黑色，含有充分成熟的胚，這類(lèi)種子占（48.35±7.82）%。

對(duì)比坐果10 d果實(shí)和成熟果實(shí)中的種子，顯然很大一部分種子在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中停止發(fā)育，果實(shí)成熟時(shí)胚停留在球形胚期、心形胚期或魚(yú)雷胚期，只有不足一半種子發(fā)育成熟。

2.4 種子敗育與其在胎座上位置的關(guān)系

西瓜胚珠發(fā)生的順序性決定了胚珠發(fā)育不同步。如前文所述，西瓜雌蕊由3心皮構(gòu)成，胎座從心皮愈合處產(chǎn)生，并向子房室中央推進(jìn)，在子房室中央會(huì)合，然后產(chǎn)生二分支，分支發(fā)生拳卷形翻轉(zhuǎn)。每一分支依次產(chǎn)生5個(gè)胚珠原基（圖2）。由于胚珠順序發(fā)生，早產(chǎn)生的胚珠較大，在發(fā)育過(guò)程中占有優(yōu)勢(shì)。最早發(fā)生的2個(gè)胚珠，即圖2-E中第1號(hào)和第2號(hào)位上的胚珠，基本都發(fā)育為成熟種子;第3號(hào)位上的胚珠部分發(fā)育成熟，部分?jǐn)∮?，胚停留在魚(yú)雷胚期;第4號(hào)位上的胚珠基本不能發(fā)育為成熟種子，胚發(fā)育到心形胚或球胚期停止發(fā)育;第5號(hào)位上的胚珠通常不能產(chǎn)生成熟胚囊。

3 討 論

本研究結(jié)果表明，種子敗育有3種情況：（1）開(kāi)花時(shí)胚珠不含胚囊，開(kāi)花后珠心退化解體，不能形成種子。（2）胚珠有胚囊，但開(kāi)花授粉期花粉管不進(jìn)入，不能實(shí)現(xiàn)受精作用，無(wú)法形成種子。（3）胚停止發(fā)育，果實(shí)成熟時(shí)，胚停留在球形胚期、心形胚期或魚(yú)雷胚期，不能發(fā)育為成熟種子。

第一種情況可能與胚珠發(fā)生的順序性特點(diǎn)有關(guān)。早發(fā)生的胚珠有充分機(jī)會(huì)發(fā)育成熟，而晚發(fā)生的胚珠發(fā)育時(shí)間較短，結(jié)果在開(kāi)花授粉時(shí)早發(fā)生的胚珠已經(jīng)具有成熟胚囊，而晚發(fā)生的胚珠中胚囊沒(méi)有機(jī)會(huì)成熟，以致退化解體。尚需更多工作來(lái)驗(yàn)證是否早發(fā)生胚珠中胚囊成熟時(shí)會(huì)產(chǎn)生抑制晚發(fā)生胚珠中胚囊發(fā)育的因子，抑制了同一子房中發(fā)育滯后的胚珠中胚囊的成熟。晚發(fā)生胚珠不產(chǎn)生正常的胚囊，不具有受精機(jī)會(huì)，停止發(fā)育，減少了對(duì)養(yǎng)分的空耗，有利于早發(fā)生胚珠向著成熟種子發(fā)育。此外，后發(fā)生的胚珠在授粉后其珠心退化，顯示了胚囊發(fā)育與胚珠發(fā)育之間的相關(guān)性，胚囊正常發(fā)育是胚珠發(fā)育的重要條件。不具成熟胚囊的胚珠必然不能發(fā)育為成熟種子[7]。

第二種情況可能暗示胚囊有生理功能障礙，不產(chǎn)生吸引花粉管的信號(hào)物質(zhì)，花粉管無(wú)法識(shí)別胚珠正確位置，無(wú)法進(jìn)入胚囊以實(shí)現(xiàn)受精作用。沒(méi)有受精的胚珠最終退化，不能形成種子。

第三種情況可能暗示發(fā)育中的種子之間存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，胚珠發(fā)生不同步，具有早發(fā)生胚珠和晚發(fā)生胚珠，當(dāng)早發(fā)生胚珠發(fā)育為成熟種子時(shí)，這些晚發(fā)生胚珠中胚的發(fā)育受到了抑制，不能達(dá)到成熟。是否成熟胚產(chǎn)生抑制因子抑制晚發(fā)生胚珠中胚的發(fā)育，尚有待更多工作予以證實(shí)。

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