運(yùn)用18S rDNA克隆文庫(kù)檢測(cè)滇池硅藻種群多樣性

胡蝶 ，皮之云 ，張志榮 ，陳燕祥 ，邢豫明 ，，程寶文 ，

（1.中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)，重慶 400038；2.昆明醫(yī)科大學(xué)，云南 昆明 650500；3.中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所，云南 昆明 650204；4.云南省公安廳，云南 昆明 650228）

硅藻因其細(xì)胞壁由不易被破壞的含水硅酸鹽構(gòu)成，在溺水過(guò)程中，硅藻可隨溺液吸入肺組織并通過(guò)血液循環(huán)播散至其他組織器官中，因此硅藻檢驗(yàn)在法醫(yī)學(xué)溺死診斷中具有重要的意義[1-4]。滇池是云南省最大的淡水湖泊，目前對(duì)滇池水域硅藻種群的研究報(bào)道較少，主要采用光學(xué)顯微鏡或掃描電鏡下形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行種屬鑒定與分類[5-7]。本研究應(yīng)用分子生物學(xué)方法對(duì)滇池水域硅藻種群分布進(jìn)行初步研究，以期為當(dāng)?shù)啬缢赖姆ㄡt(yī)學(xué)鑒定提供參考以及為滇池水域的生物多樣性研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2017年3月22日在滇池6個(gè)水樣采集點(diǎn)［草海1個(gè)（圖1A）、外海5個(gè)（圖1B～F）］水面下0.1～0.5m處采集6份水樣，各500mL，靜置過(guò)夜，棄250mL上層水樣，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 滇池水樣采集點(diǎn)分布

1.2 總DNA制備

各取2 mL水樣置于微量離心管中，以離心半徑10cm，12000r/min，離心20min，棄上清液，再加入水樣離心，棄上清液，反復(fù)6次，管底得到沉淀物。沉淀物用PowerSoil? DNA Isolation試劑盒（美國(guó)Mobio公司）提取DNA，操作步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3 PCR擴(kuò)增

采用Primer Premier 5.0軟件（美國(guó)Premier Biosoft公司）設(shè)計(jì)硅藻18S rDNA特異性引物605F：5′-CTGCGAACGCTCATTAT-3′；605R：5′-AGGCCCGG CATTGTTATT-3′。PCR反應(yīng)總體積為20μL：去離子水 12.3 μL，10×PCR 緩沖液 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，10 μmol/L正反引物各0.2 μL，Taq DNA聚合酶0.3μL，DNA模板1μL。反應(yīng)條件：95℃ 3min；94℃30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用Good ViewTM核酸染料（北京賽百盛基因技術(shù)有限公司）染色，通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳顯帶，數(shù)據(jù)用相機(jī)拍照固定。

1.4 克隆文庫(kù)構(gòu)建

PCR產(chǎn)物用SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］純化，純化產(chǎn)物運(yùn)用pLB零背景快速連接試劑盒［VT205，天根生化科技（北京）有限公司］克隆。隨機(jī)挑取陽(yáng)性菌斑直接進(jìn)行載體引物PCR擴(kuò)增檢測(cè)，陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物用Product Pre-Sequencing試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）純化。純化體系：蝦堿性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase，SAP）1.5μL，Exo-1 0.15μL，去離子水1.35 μL，擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL。反應(yīng)條件：37℃ 60 min，85℃ 15min。測(cè)序反應(yīng)體系：去離子水4μL，測(cè)序緩沖液 1 μL，測(cè)序反應(yīng)試劑 0.3 μL，10 μmol/L 載體正向引物 0.25 μL，DNA 模板 0.5 μL。測(cè)序反應(yīng)條件：95℃ 30 s；96℃ 10 s，50℃ 5 s，60℃ 3 min；32個(gè)循環(huán)。測(cè)序產(chǎn)物用葡聚糖凝膠G-50（中DNA級(jí)，美國(guó)GE Healthcare公司）純化，3500基因分析儀（美國(guó)AB公司）測(cè)序。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

擴(kuò)增序列通過(guò)BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對(duì)以確定序列種屬，運(yùn)用MEGA v7.0.14軟件（分子進(jìn)化遺傳學(xué)研究所，Institute of Molecular Evolutionary Genetics）以距離矩陣鄰接法構(gòu)建滇池水域硅藻18S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié) 果

2.1 DNA擴(kuò)增結(jié)果

采用PowerSoil?DNA Isolation試劑盒分別提取6份水樣硅藻的DNA，并運(yùn)用滇池硅藻18S rDNA特異性引物605F和605R進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到預(yù)期目標(biāo)片段，片段大小約400bp（圖2）。

圖2 滇池6個(gè)水樣采集點(diǎn)硅藻18S rDNA擴(kuò)增結(jié)果

2.2 滇池硅藻種群多樣性

6個(gè)硅藻18S rDNA克隆文庫(kù)各挑取40個(gè)克隆子載體引物擴(kuò)增測(cè)序，共獲得196個(gè)DNA序列（表1），通過(guò)BLAST比對(duì)，196個(gè)序列中有167個(gè)硅藻序列，包括冠盤藻屬、等片藻屬、直鏈藻屬、菱形藻屬、小環(huán)藻屬、海鏈藻屬、脆桿藻屬、舟形藻屬、異極藻屬、曲殼藻屬、楔形藻屬11個(gè)硅藻種屬（表2）。

6個(gè)采集點(diǎn)間檢出硅藻種群數(shù)量不一致，海埂北側(cè)的草海水樣檢出冠盤藻、小環(huán)藻、海鏈藻、舟形藻、菱形藻、脆桿藻6類硅藻，海埂南側(cè)的外海水樣檢出冠盤藻、小環(huán)藻、菱形藻、等片藻、直鏈藻5類硅藻，觀音山水樣檢出冠盤藻、菱形藻2類硅藻，東大河濕地公園水樣檢出冠盤藻、小環(huán)藻、海鏈藻、菱形藻、曲殼藻5類硅藻，撈魚河濕地公園水樣檢出冠盤藻、小環(huán)藻、海鏈藻、舟形藻、菱形藻、等片藻、異極藻7類硅藻，海東濕地公園水樣檢出小環(huán)藻、直鏈藻、楔形藻3類硅藻。

196個(gè)序列中有20個(gè)為金藻序列（表3），包括囊胞藻屬、魚鱗藻屬、棕鞭藻屬、黃群藻屬，其余9個(gè)序列主要包括細(xì)菌、真菌等。

表1 各水樣的測(cè)序情況 （個(gè)）

表2 各水樣硅藻種屬和數(shù)量 （個(gè)）

表3 各水樣金藻種屬和數(shù)量 （個(gè)）

2.3 滇池水域硅藻、金藻18S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹

本研究所獲得的11類硅藻18S rDNA序列和4類金藻18S rDNA序列通過(guò)BLAST進(jìn)行相似性比對(duì)，部分序列與硅藻18S rDNA序列具有較高同源性，將相似性較高的序列作為標(biāo)準(zhǔn)序列，利用MEGA v7.0.14軟件采用鄰接法聚類分析[8]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，滇池水域所檢出的硅藻與金藻關(guān)系較近。

3 討 論

硅藻廣泛分布于海洋、淡水或陸地濕潤(rùn)土壤中，種類繁多，大小不一，從幾微米至數(shù)毫米，且形態(tài)各異[9]。傳統(tǒng)的硅藻分類研究是借助顯微鏡觀察硅藻的形態(tài)學(xué)特征鑒定種屬，這就需要研究人員具有非常豐富的分類學(xué)經(jīng)驗(yàn)，且工作量大，耗時(shí)長(zhǎng)，結(jié)果易受人為主觀因素干擾，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化難度較大[10]。有文獻(xiàn)[6-7]報(bào)道用傳統(tǒng)方法對(duì)滇池浮游生物進(jìn)行多樣性監(jiān)測(cè)，滇池硅藻有小環(huán)藻屬、冠盤藻屬、直鏈藻屬、脆桿藻屬、平板藻屬、針桿藻屬、等片藻屬、舟形藻屬、羽紋藻屬、異極藻屬、菱形藻屬11個(gè)屬。本研究運(yùn)用分子技術(shù)從硅藻18S rDNA序列的分析對(duì)滇池水域硅藻進(jìn)行鑒定和分類，檢出冠盤藻屬、等片藻屬、直鏈藻屬、菱形藻屬、小環(huán)藻屬、海鏈藻屬、脆桿藻屬、舟形藻屬、異極藻屬、曲殼藻屬、楔形藻屬11個(gè)屬。但未檢出傳統(tǒng)方法可檢出的平板藻、針桿藻、羽紋藻3類硅藻，卻檢出海鏈藻、曲殼藻和楔形藻。其原因可能與以下4個(gè)方面有關(guān)：（1）采樣時(shí)間不同，滇池水質(zhì)狀況不同，硅藻種群結(jié)構(gòu)會(huì)有所差異；（2）與本研究所用引物的敏感性和偏好性有關(guān)；（3）本研究所檢測(cè)的硅藻18S rDNA序列分辨率有限；（4）傳統(tǒng)方法具有一定的局限性。因此，本研究結(jié)果是對(duì)以往研究的驗(yàn)證與補(bǔ)充，使得滇池水域硅藻種群數(shù)據(jù)更加完善。

滇池6個(gè)采集點(diǎn)間硅藻種群結(jié)構(gòu)存在差異，首先，草海檢出6類硅藻，外海檢出10類硅藻，只有草海檢出脆桿藻，外海的5個(gè)采集點(diǎn)水樣均未檢出脆桿藻。海埂兩側(cè)水域的硅藻群落有明顯差異，草海與外海之間有一航道相通，航道最南端修有人工閘門限制湖水流通是形成海埂兩側(cè)水域硅藻群落差異的主要原因，其次是草海底泥清淤相對(duì)較為徹底，湖濱濕地修復(fù)效果較好，形成了良好的湖濱濕地生態(tài)系統(tǒng)，水質(zhì)較前有所好轉(zhuǎn)[7，11]。滇池外海硅藻種群豐富，包括除脆桿藻之外的10類硅藻。東西兩岸采水點(diǎn)水域硅藻種群結(jié)構(gòu)差異明顯，西岸觀音山水域硅藻種群結(jié)構(gòu)最為單一；東岸的撈魚河濕地公園水域的硅藻種群結(jié)構(gòu)最為豐富。外海東岸的撈魚河濕地公園水域與海東濕地公園水域間也有一定的差異，海東濕地公園水域硅藻種群相對(duì)單一。外海面積較大，湖流緩慢，湖面常年以西南風(fēng)為主，外海北岸藍(lán)藻堆積，水質(zhì)較差[11]，硅藻種群相對(duì)單一，東岸沿線湖濱濕地生態(tài)系統(tǒng)的建設(shè)較完善，光照充足，西南邊出水口通暢，硅藻種群相對(duì)豐富。不同水域的硅藻種群差異對(duì)于法醫(yī)學(xué)溺水地點(diǎn)的推斷具有一定的意義。

滇池面積廣闊，本研究的水樣采集點(diǎn)未能涉及湖泊中央?yún)^(qū)域以及季節(jié)交替所致種群差異，如果建立滇池水域硅藻種群數(shù)據(jù)庫(kù)，還需進(jìn)一步擴(kuò)大取樣范圍以及更深入地研究分析積累數(shù)據(jù)，才能更全面、準(zhǔn)確地反映出滇池水域的硅藻分布情況。