過敏性休克死亡豚鼠肺組織中CD63的表達

（中國醫(yī)科大學法醫(yī)學院，遼寧 沈陽 110122）

過敏性休克是臨床常見的急癥之一，發(fā)病突然，尤其藥物所致過敏性休克死亡者，常常引發(fā)醫(yī)患糾紛。常規(guī)的尸體解剖和組織病理學檢驗常常缺乏特異性的病理學改變，因此過敏性休克死亡是法醫(yī)學鑒定的一大難題。深入探討過敏性休克發(fā)生的機制，尋找準確可靠的診斷指標和簡單易行的診斷方法，已經成為法醫(yī)學研究的重要內容之一。

嗜堿性粒細胞在過敏性炎癥反應中發(fā)揮著重要作用。分化抗原簇63（cluster of differentiation 63，CD63）是一個四次跨膜超家族成員。在靜止的嗜堿性粒細胞中，CD63位于細胞內分泌顆粒膜上，當被IgE受體FcεRI激活后，這些顆粒與細胞膜融合，CD63就表達在脫顆粒的嗜堿性粒細胞表面[1]。應用流式細胞學等技術研究發(fā)現(xiàn)，在過敏反應中當機體再次接觸過敏原時，嗜堿性粒細胞膜表面表達多種蛋白標志物，如 CD13、CD45、CD63、CD69、CD203c、CD107a和CD164等表達明顯上調[1-2]。其中，CD63和CD203c被認為是嗜堿性粒細胞活化的重要標志物[3]。SANZ等[4]報道，在粉塵螨過敏的哮喘患者中，嗜堿性粒細胞激活后CD63表達的靈敏度及特異度均較高。在IgE介導的食物過敏中，通過檢測嗜堿性粒細胞CD63有助于食物過敏的診斷[5]。因此，CD63在過敏反應中發(fā)揮的作用不容忽視。

目前，國內外對過敏性休克CD63的表達研究僅局限于血液嗜堿性粒細胞[6-10]。本實驗通過對過敏性休克死亡豚鼠肺組織中CD63的表達進行研究，采用人混合血清注射建立過敏性休克死亡豚鼠動物模型。應用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色觀察肺組織形態(tài)學變化，應用免疫組織化學染色、Western印跡法和酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測肺組織中CD63蛋白的表達情況，并采用real-time RT-PCR檢測肺組織CD63 mRNA的表達變化，以探討CD63對過敏性休克死亡的診斷價值。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

健康成年豚鼠20只，體質量250～300g，購自北京維通利華公司，適應性飼養(yǎng)1周。將實驗動物隨機分為對照組，過敏性休克死亡即刻組、冷藏組（4℃貯藏48h）、冷凍組（-20℃貯藏7d），每組5只。本實驗經中國醫(yī)科大學動物倫理委員會批準。

1.2 試劑和儀器

山羊抗兔SP檢測試劑盒（SP-9001）、小鼠抗βactin抗體（TA-09）與辣根過氧化物酶結合的山羊抗兔IgG（ZB-2301）均購自北京中杉金橋生物技術有限公司，兔抗CD63抗體（25682-1-AP）購自武漢三鷹生物技術有限公司，Total RNA提取試劑（D9108）、反轉錄試劑盒（RR037A）與染料法熒光定量試劑盒（RR820A）均購自寶生物工程（大連）有限公司，CD63 ELISA試劑盒（CSB-E14117r）購自武漢華美生物工程有限公司。

7500型實時熒光定量PCR儀（美國AB公司）、Tanon5500化學發(fā)光分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）、TP600型PCR儀（日本TaKaRa公司）、ELX808吸收光酶標儀（美國BioTek公司）、BG-verMINI垂直電泳儀（北京百晶生物技術有限公司）、BX41光學顯微鏡（日本Olympus公司）、Motic Images Advanced 3.2圖像分析系統(tǒng)（廈門麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型的建立及取材

按文獻[8]的方法建立動物模型，過敏性休克死亡即刻組、冷藏組、冷凍組均將0.5mL人混合血清用生理鹽水以體積比1∶10稀釋，注射于豚鼠后掌皮內致敏。普食喂養(yǎng)2周后，心腔內注射人混合血清1 mL，誘發(fā)過敏反應，動物迅速死亡。對照組以等量生理鹽水替代混合血清，用頸椎脫臼法處死。冷藏組和冷凍組的動物尸體用塑料袋密封后分別于冰箱4℃冷藏48h和-20℃冷凍7d后解凍解剖。提取肺組織，左肺上葉肺組織固定、石蠟包埋、切片制作，用于HE染色和免疫組織化學染色，右肺上葉肺組織超聲打碎，用于Western印跡法、ELISA、real-time RT-PCR檢驗。

1.3.2 HE染色

各組肺組織于4%多聚甲醛溶液4℃下固定24 h后進行脫水、透明、浸蠟、包埋，制備5 μm厚石蠟切片，常規(guī)HE染色，光學顯微鏡下觀察。

1.3.3 免疫組織化學染色

采用兔鏈霉卵白素-生物素法，兔抗CD63一抗4℃孵育過夜，其余步驟同試劑盒說明書。染色過程中以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）代替一抗作為空白對照。光學顯微鏡下觀察，拍照。

應用Motic Images Advanced 3.2圖像分析系統(tǒng)對CD63免疫組織化學染色的肺組織切片進行觀察，在高倍視野（×400）下對每張切片隨機選取5處，計算單位面積內陽性細胞（染成棕黃色的細胞）個數，取平均值作為各切片的測定結果。

1.3.4 Western印跡法

提取的肺組織勻漿標本用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法進行蛋白定量。取等量樣品，加入等體積的6×上樣緩沖液混勻，置入100℃金屬浴中5 min，以10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）的凝膠電泳分離，分離的蛋白用濕轉法轉移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜，室溫下用5%脫脂奶粉溶液封閉2h后加入用含有吐溫的Tris緩沖鹽溶液（Tris-buffered saline tween，TBST）稀釋的一抗，4℃過夜（稀釋度1∶500）；用TBST洗滌3次，每次5min；用TBST稀釋的辣根過氧化物酶結合的山羊抗兔IgG（稀釋度1∶5 000）孵育2 h；用化學發(fā)光法顯色，Tanon5500化學發(fā)光分析系統(tǒng)拍照、分析。

1.3.5 ELISA檢測

標準品配制：按照ELISA試劑盒說明書配制。

提取的肺組織放入1mL冷PBS中勻漿，-20℃過夜，反復凍融兩次破壞細胞膜；室溫解凍后以5000×g離心5 min，取上清液；進行預實驗確定稀釋倍數；每孔加入標準品或待測樣本100μL，輕晃混勻，覆上板貼，37℃溫育2h；棄去液體，甩干，不洗；每孔加生物素標記抗體工作液100 μL，覆上新板貼，37℃溫育1 h；棄去孔內液體，甩干，洗板3次，每次2 min；每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液100μL，覆上新板貼，37℃溫育1 h；棄去孔內液體，甩干，洗板5次，每次2 min；依序每孔加底物溶液90 μL，37℃避光顯色20 min；依序每孔加終止溶液50 μL，終止反應；5min內用酶標儀在450nm波長下測量各孔的光密度（D）。利用Curve Expert 1.3軟件（www.curveexpert.net）對結果進行分析，并計算樣本濃度。

1.3.6 real-time RT-PCR檢測

按照說明書用Total RNA提取試劑提取肺組織總RNA，立即用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA。得到的cDNA與特定的引物序列（CD63的上游引物為5′-ACAAGGTGAGGAGAGT-3′，下游引物為 5′-ATA CAGCAGGAGTCAGGAA-3′；β-actin的上游引物為5′-CTCACTCTCCACCTTCCA-3′，下游引物為 5′-CA ACTGCTGTCACCTTCA-3′）進行real-time RT-PCR。利用染料法熒光定量試劑盒在7500型實時熒光定量PCR儀下進行PCR擴增。通過比較Ct值（ΔΔCt）的方法測定CD63和β-actin的cDNA相對含量。

1.4 統(tǒng)計學處理

免疫組織化學法測得陽性細胞數、Western印跡法所得條帶灰度值、ELISA檢測樣本濃度值、real-time RT-PCR檢測cDNA相對含量值均以±s表示，使用GraphPad Prism 6.0軟件進行統(tǒng)計學分析。各過敏性休克組與對照組比較，使用單因素方差分析進行統(tǒng)計；各過敏性休克組組間比較，使用Tukey檢驗進行統(tǒng)計分析。檢測水準α=0.05。

2 結 果

2.1 豚鼠過敏性休克死亡的觀察

致敏豚鼠心腔內注射混合血清后1min左右便出現(xiàn)搔鼻、躁動、流涎、抽搐、呼吸困難、四肢軟弱無力、口唇黏膜發(fā)紺、大小便失禁，全部于1～5min死亡。解剖動物尸體，見豚鼠喉頭和肺組織水腫，各器官組織明顯淤血。對照組注射生理鹽水后無異常表現(xiàn)。

2.2 HE染色形態(tài)觀察

對照組豚鼠肺組織細支氣管、肺泡結構清晰，肺泡間隔正常，未見明顯病理改變。過敏性休克死亡即刻組、冷藏組和冷凍組的豚鼠肺組織淤血、水腫，部分肺泡腔擴張，肺泡壁破裂，肺內細支氣管壁內和肺泡壁內散在嗜酸性粒細胞浸潤（圖1）。

圖1 豚鼠肺組織HE染色結果（×400）

2.3 CD63免疫組織化學染色

CD63作為嗜堿性粒細胞和肥大細胞的活化標志物，染色產物位于肥大細胞和嗜堿性粒細胞等細胞內，呈棕黃色。對照組豚鼠肺間質內散在少量陽性細胞，但過敏性休克死亡豚鼠的肺間質彌漫分布呈棕黃色染色的陽性細胞，數目較對照組增多（P＜0.05）。各過敏性休克組間陽性細胞數差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖2，表1）。

圖2 豚鼠肺組織CD63免疫組織化學染色（×400）

表1 豚鼠肺組織CD63免疫組織化學染色陽性細胞數（n=5，±s）

表1 豚鼠肺組織CD63免疫組織化學染色陽性細胞數（n=5，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05。

陽性細胞數2.8±1.9 11.0±3.81）13.0±4.21）9.5±2.01）組別對照死亡即刻冷藏冷凍

2.4 肺組織中CD63蛋白表達變化

Western印跡法結果（圖3，表2）顯示：豚鼠肺組織中CD63蛋白表達水平在死亡即刻組與冷凍組明顯高于對照組（P＜0.05）；死亡即刻組與冷藏組、冷凍組蛋白表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖3 豚鼠肺組織CD63 Western印跡法檢測結果

表2 豚鼠肺組織CD63蛋白及mRNA相對表達量（n=5，±s）

表2 豚鼠肺組織CD63蛋白及mRNA相對表達量（n=5，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05。

CD63 mRNA 1.00±0.19 19.74±1.361）24.99±3.671）20.12±4.441）組別對照死亡即刻冷藏冷凍CD63蛋白1.00±0.14 3.97±1.681）3.06±0.54 4.11±1.211）

ELISA檢測結果顯示：豚鼠肺組織中CD63蛋白表達水平在死亡即刻組為（11.19±1.79）pg/mg、對照組為（7.29±0.48）pg/mg，死亡即刻組高于對照組（P＜0.05）。

2.5 肺組織中CD63 mRNA表達變化

豚鼠肺組織中CD63 mRNA表達水平在死亡即刻組、冷藏組、冷凍組均高于對照組（P＜0.05）；死亡即刻組與冷藏組、冷凍組CD63 mRNA表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表2）。

3 討 論

本實驗采用經典的人混合血清誘發(fā)豚鼠過敏性休克死亡動物模型[11]。已致敏的豚鼠再次注射人混合血清后1min左右實驗動物出現(xiàn)搔鼻、躁動、流涎、抽搐、呼吸困難、四肢軟弱無力、口唇黏膜發(fā)紺、大小便失禁等過敏性休克癥狀，所有豚鼠于激發(fā)過敏后5 min內死亡。解剖見豚鼠肺水腫、各器官組織淤血。對照組注射生理鹽水后無異常表現(xiàn)。HE染色組織病理學檢驗見肺組織水腫，部分肺泡擴張、破裂，肺組織嗜酸性粒細胞浸潤。對照組未見明顯改變。豚鼠過敏性休克死亡動物模型成功建立。

CD63被稱為溶酶體相關膜糖蛋白-3（lysosomalassociated membrane glycoprotein-3，LAMP-3），是一個相對分子質量為53 000的四次跨膜超家族成員。CD63除在活化的嗜堿性粒細胞膜表面表達外，也表達在血小板、內皮細胞、淋巴細胞、單核細胞以及中性粒細胞膜表面[12]。嗜堿性粒細胞是過敏反應的重要效應細胞之一，觀察其是否激活有助于過敏狀態(tài)的診斷。關于嗜堿性粒細胞在過敏性疾病中角色的早期研究集中于介質釋放，如組胺和白三烯[13-15]。早期的研究結果[1，16]表明，CD63與包含組胺的內分泌顆粒有關，這說明CD63上調可以作為組胺釋放的間接標志。然而，最近的研究結果[17]顯示，組胺釋放可能是過敏性脫顆粒和片段狀脫顆粒的總和，并且CD63的上調可能僅僅是過敏性脫顆粒的代表。嗜堿性粒細胞發(fā)揮其生物學功能有賴于其活化。研究[1-2]發(fā)現(xiàn)，其活化后表面膜蛋白CD63表達上調，因此，CD63被認為是嗜堿性粒細胞活化的標記蛋白。鄧真真[18]發(fā)現(xiàn)檢測胞膜CD63的表達情況可評估嗜堿性粒細胞的活化狀態(tài)。

CD63在特異性IgE介導的肥大細胞的脫顆粒與過敏反應中發(fā)揮重要作用。研究結果[1]表明，用抗IgE抗體激活人嗜堿性粒細胞后，用流式細胞技術檢測，發(fā)現(xiàn)其表面的CD63表達增加，說明肥大細胞脫顆粒的過程是細胞內嗜堿性顆粒運動到細胞膜表面，與細胞膜融合后，釋放出顆粒內活性物質的過程，CD63的表達與脫顆粒呈正相關[16]。有研究[19]利用CD63基因敲除小鼠研究CD63在肥大細胞中的作用，發(fā)現(xiàn)CD63缺乏并未影響體內肥大細胞的數量及組織分布。骨髓源性肥大細胞在缺乏CD63蛋白的情況下發(fā)育正常。然而，缺乏CD63顯著降低IgE受體FcεRI介導的骨髓源性肥大細胞脫顆粒，進而減少體內的急性過敏反應，證明CD63對IgE介導的肥大細胞脫顆粒和過敏是必要的[19]。在對食物、花粉過敏患者的研究[4-5]中發(fā)現(xiàn)，嗜堿性粒細胞激活后CD63表達的敏感性和特異性較高，并與組胺和白三烯釋放的水平顯著相關。

本研究通過對過敏性休克死亡豚鼠肺組織的免疫組織化學染色和陽性細胞數計數統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)對照組和各過敏性休克組的肺組織內均有CD63的陽性表達，染色顆粒呈棕黃色，陽性細胞主要分布于肺間質內。對照組的陽性細胞反映了嗜堿性粒細胞和肥大細胞的正常形態(tài)、數量和分布。死亡即刻組肺組織中CD63陽性細胞的免疫組織化學染色較對照組明顯加深，陽性細胞數也明顯增多，非特異性染色少，可見肺組織可以成為良好的診斷器官，這與景麗霞等[6]采用熒光免疫組織化學染色法所觀察到的過敏性休克死亡即刻組大鼠肺組織中嗜堿性粒細胞CD63數目表達較對照組增多的結果相一致。本研究對4℃冷藏48 h和-20℃冷凍7 d保存條件下豚鼠過敏性休克死亡肺組織中CD63蛋白的免疫組織化學染色進行檢查，并與死亡即刻組進行比較，發(fā)現(xiàn)這兩種保存條件對CD63的免疫組織化學染色及蛋白表達變化影響不大。進一步應用Western印跡法檢測，發(fā)現(xiàn)死亡即刻組肺組織中CD63蛋白表達高于對照組，免疫組織化學染色結果也證實了這一點。冷藏組、冷凍組肺組織中CD63的蛋白表達量與死亡即刻組比較差異無統(tǒng)計學意義。ELISA檢測發(fā)現(xiàn)死亡即刻組肺組織CD63蛋白表達量明顯高于對照組。本研究結果在蛋白水平充分證明了過敏性休克肺組織中CD63表達增強，并進一步證明了4℃冷藏48 h和-20℃冷凍7 d保存條件對CD63蛋白檢測沒有明顯影響。經real-time RTPCR檢查，發(fā)現(xiàn)死亡即刻組、冷藏組、冷凍組肺組織CD63 mRNA表達相對于對照組增長了20倍，差異有統(tǒng)計學意義，這從蛋白質轉錄水平證明了上述豚鼠過敏性休克肺組織中CD63蛋白檢測結果的科學性和可靠性。本研究結果證實了CD63對過敏性休克的診斷具有良好的靈敏度和特異度，有望成為過敏性休克的輔助診斷指標。