尋常性銀屑病患者白細(xì)胞介素表達(dá)水平及與銀屑病面積和嚴(yán)重度指數(shù)相關(guān)性研究

夏米娜，劉彥群，翟曉翔

尋常性銀屑病是臨床上較為常見(jiàn)的慢性炎癥性皮膚病，鱗屑性紅斑是主要的臨床表現(xiàn)，復(fù)發(fā)率比較高，對(duì)患者生活、工作影響甚大，其病情的發(fā)生和發(fā)展受環(huán)境、遺傳等多種因素影響[1,2]。近年來(lái)，大量研究顯示，多種細(xì)胞因子與銀屑病的發(fā)生發(fā)展存在一定的聯(lián)系，與患者銀屑病皮損面積和嚴(yán)重度指數(shù)（PASI）評(píng)分有相關(guān)性[2,3]。相關(guān)研究指出，IL-36與銀屑病發(fā)病有著密切聯(lián)系，IL-36α和IL-36γ在銀屑病患者皮損中顯著高表達(dá)。IL-36Ra是IL-36的天然受體拮抗劑，IL-36Ra發(fā)生基因突變導(dǎo)致其與IL-36的結(jié)合能力下降，促使機(jī)體皮膚組織病理反應(yīng)增強(qiáng)，引起銀屑病發(fā)生。IL-38對(duì)免疫細(xì)胞的生物學(xué)作用與IL-36Ra相似，與銀屑病的發(fā)生密切相關(guān)。本文旨在對(duì)比尋常性銀屑病患者血清IL-36、IL-36Ra、IL-38表達(dá)水平與正常人的差異，分析其與患者PASI評(píng)分之間的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 臨床資料 選擇2016年1月—2017年6月徐州市中醫(yī)院皮膚科接診治療的尋常性銀屑病患者78例，其中男45例，女33例；年齡24～62歲，平均年齡（47.7±14.9）歲。所選取的患者均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)尋常性銀屑病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]：臨床表現(xiàn)為表面附著厚層銀白色鱗屑，輕刮鱗屑后基底見(jiàn)淡紅色發(fā)光半透明薄膜，刮除薄膜出現(xiàn)點(diǎn)狀出血，即為蠟滴現(xiàn)象、薄膜現(xiàn)象、點(diǎn)狀出血現(xiàn)象。早期組織病理學(xué)檢查表現(xiàn)為表皮角化過(guò)度伴有角化不全，后期表現(xiàn)為角化過(guò)度，以淋巴細(xì)胞和組織細(xì)胞浸潤(rùn)為主。排除近期使用糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑、有嚴(yán)重急慢性系統(tǒng)疾病、免疫性疾病及精神障礙的患者，所選擇的患者均符合尋常性銀屑病臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)。選擇我院同期體檢的健康志愿者78例作為對(duì)照組，其中男41例，女37例；年齡22～61歲，平均年齡（46.8±15.2）歲；兩組在性別、年齡、一般資料相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究所選患者及志愿者均事先知情，簽署知情確認(rèn)書(shū)，并獲得了本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（上海生物工程公司）；免疫組化染色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 病情評(píng)定 患者入院后，采用PASI評(píng)分對(duì)患者病情進(jìn)行分級(jí)，按照頭頸部、上肢、軀干、下肢4個(gè)部分對(duì)全身進(jìn)行分區(qū)，面積評(píng)分：檢查計(jì)算每部分病變面積百分比，按照0～6進(jìn)行評(píng)分。嚴(yán)重程度評(píng)分：對(duì)每一部分紅斑、浸潤(rùn)、鱗屑3項(xiàng)臨床特征分別進(jìn)行評(píng)分，每項(xiàng)臨床特征按照0～4評(píng)分，嚴(yán)重度評(píng)分為各項(xiàng)臨床特征評(píng)分相加。PASI（頭部）=0.1×面積評(píng)分×嚴(yán)重度評(píng)分，PASI（上肢）=0.2×面積評(píng)分×嚴(yán)重度評(píng)分，PASI（軀干）=0.3×面積評(píng)分×嚴(yán)重程評(píng)分，PASI（下肢）=0.4×面積評(píng)分×嚴(yán)重度評(píng)分，PASI總分為4分部評(píng)分相加。根據(jù)PASI總分進(jìn)行病情分級(jí)，輕度：PASI≤15，中度：15＜PASI＜30，重度：PASI≥30。

1.2.2 ELISA檢測(cè)IL-36、IL-36Ra及IL-38水平 采集銀屑病患者和對(duì)照者清晨空腹靜脈血5 ml，2 000 r/min離心處理10 min，采集上層血清，-80℃低溫儲(chǔ)存?zhèn)溆?。采用ELISA測(cè)定IL-36、IL-36Ra及IL-38水平，具體操作如下：采用競(jìng)爭(zhēng)性抑制法ELISA試劑盒，使用純化抗體包被微孔板，使抗體充分吸附于微孔壁，制作固相載體，實(shí)驗(yàn)中加入待測(cè)樣本和酶聯(lián)親和物，酶聯(lián)親和物含有酶標(biāo)記抗原，采取溫育反應(yīng)使其充分結(jié)合在微孔壁上，通過(guò)與抗體競(jìng)爭(zhēng)從而形成標(biāo)記的抗原復(fù)合物，洗去未結(jié)合部分，加入底物反應(yīng)后變色，讀取標(biāo)準(zhǔn)品孔的吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后反算出待測(cè)樣本的指標(biāo)濃度數(shù)值。

1.2.3 免疫組化染色 采集78例患者皮損組織，從典型皮損位置處切取，切取范圍可擴(kuò)大至皮損邊緣正常皮膚。采集的皮膚組織置于10%甲醛磷酸緩沖液中進(jìn)行固定，對(duì)固定后的皮膚組織進(jìn)行脫水，透明后石蠟包埋，制成蠟塊后備用。每例患者至少制作5組切片，分別檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)染色結(jié)果。采用免疫組化染色試劑盒進(jìn)行染色操作，具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，根據(jù)光學(xué)顯微鏡拍照結(jié)果判斷陽(yáng)性率。胞核或胞質(zhì)內(nèi)含有棕色顆粒的細(xì)胞被視為陽(yáng)性細(xì)胞，細(xì)胞因子IL-36、IL-36Ra、IL-38主要分布于胞質(zhì)。陰性對(duì)照為無(wú)明顯染色顆粒或組織顏色與背景色相一致。在顯微鏡下觀察表皮全層陽(yáng)性細(xì)胞的染色深度和分布情況，高倍鏡視野（×200）下取5個(gè)視野，采用Image pro plus 6.0軟件分析圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)，應(yīng)用非參數(shù)spearman相關(guān)性檢驗(yàn)因子表達(dá)水平與相應(yīng)的PASI評(píng)分的相關(guān)性，組間計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同病情分級(jí)患者一般資料比較

輕度與中重度患者男女比例、平均年齡相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見(jiàn)表1。

表1 不同病情分級(jí)患者一般資料比較 （±s）

表1 不同病情分級(jí)患者一般資料比較 （±s）

指 標(biāo) 輕度患者 中重度患者 P值PASI評(píng)分 8.9±1.4 21.4±2.1 ＜0.05總例數(shù)（例） 35 43男性比例[例(%)]21(55.2) 26(52.9) ＞0.05女性比例[例(%)]14(44.8) 17(47.1) ＞0.05平均年齡（歲） 47.4±14.6 48.1±15.1 ＞0.05

2.2 IL-36、IL-36Ra及IL-38在不同病情分級(jí)患者中的免疫組化染色結(jié)果

圖1 IL-36、IL-36Ra及IL-38在不同病情分級(jí)銀屑病患者中的免疫組化組織病理（DAB染色×200）

通過(guò)對(duì)不同病情分級(jí)患者及正常人皮膚組織的免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，各因子在不同病情分級(jí)患者及正常人皮膚組織中均有表達(dá)。不同病情分級(jí)尋常性銀屑病患者IL-36α主要表達(dá)在表皮各層細(xì)胞胞質(zhì)中，且中重度患者明顯多于輕度患者；IL-36β主要表達(dá)在顆粒層和棘層細(xì)胞，但是在不同病情分級(jí)尋常性銀屑病患者表皮各層細(xì)胞胞核、核周及胞質(zhì)中，也均有不同程度的表達(dá)，且中重度患者明顯多于輕度患者；IL-36γ主要表達(dá)顆粒層及鄰近的棘層細(xì)胞，而在正常人皮膚組織中表達(dá)顯著少于尋常性銀屑病患者；IL-36Ra與上述相反，其在不同病情分級(jí)的尋常性銀屑病患者皮膚組織中幾乎無(wú)表達(dá)，而在正常人的皮膚組織中表達(dá)于基底層；IL-38在正常人皮膚組織表皮各層細(xì)胞胞質(zhì)中均有表達(dá)，而在尋常性銀屑病患者皮膚組織中，僅在棘層細(xì)胞胞質(zhì)中散在表達(dá)（圖1）。

2.3 IL-36、IL-36Ra及IL-38表達(dá)水平比較

輕度及中重度尋常性銀屑病患者IL-36α、IL-36β、IL-36γ表達(dá)水平高于對(duì)照組，IL-36Ra和IL-38表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；中重度患者 IL-36α、IL-36β、IL-36γ表達(dá)水平高于輕度患者，IL-36Ra和IL-38表達(dá)水平低于輕度患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見(jiàn)表2。

表2 IL-36、IL-36Ra及IL-38表達(dá)水平比較 （±s，ng/L）

表2 IL-36、IL-36Ra及IL-38表達(dá)水平比較 （±s，ng/L）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與輕度患者相比，#P＜0.05

指 標(biāo) 對(duì)照組 輕度患者 中重度患者 *P值 #P值IL-36α 1.312± 0.129 2.026± 0.203* 2.718±0.251*# 0.009 0.022 IL-36β 5.916± 0.774 7.483± 0.955* 9.805±0.859*# 0.014 0.019 IL-36γ 15.437± 2.119 21.204± 2.669* 29.103±3.179*# 0.011 0.009 IL-36Ra 81.705± 7.066 72.592± 6.308* 61.426±8.153*# 0.007 0.015 IL-38 128.658±11.229 107.319±13.028* 84.671±9.275*# 0.011 0.011

2.4 IL-36、IL-36Ra及IL-38表達(dá)水平與PASI評(píng)分相關(guān)性

IL-36α、IL-36β、IL-36γ表達(dá)水平與 PASI評(píng)分呈正相關(guān)性，P＜0.01；IL-36Ra和IL-38表達(dá)水平與PASI評(píng)分呈負(fù)相關(guān)性，P＜0.05，詳見(jiàn)表3。

表3 IL-36、IL-36Ra及IL-38表達(dá)水平與PASI評(píng)分相關(guān)性

3 討論

近年來(lái)，我國(guó)銀屑病的發(fā)病人數(shù)逐年上升，多為尋常性銀屑病。該病治療難度大，病情易復(fù)發(fā)，具有“隱性發(fā)病”的特征。另外病情的發(fā)生發(fā)展受環(huán)境、機(jī)體免疫功能及遺傳等多種因素影響，發(fā)病后對(duì)患者的工作、生活造成較大的負(fù)面影響，所以需要加強(qiáng)疾病防治[4]。

IL由白細(xì)胞產(chǎn)生并作用于白細(xì)胞之間，在機(jī)體的信息傳遞、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞活化、增殖分化及炎癥反應(yīng)中有著重要的作用，與細(xì)胞生長(zhǎng)因子協(xié)同作用，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫和造血功能[5-8]。目前發(fā)現(xiàn)了至少38種IL，按照IL-1～I(xiàn)L-38編號(hào)。相關(guān)研究指出，IL-17、IL-21、IL-37等多種細(xì)胞因子在銀屑病皮損中均有顯著地表達(dá)，對(duì)于銀屑病的病情分析有著重要的價(jià)值和意義[9-11]。IL-36是IL-1的家族成員之一，可由活化后的B淋巴細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生，包括 IL-36γ、IL-36α、IL-36β 3種次分類(lèi)，其中 IL-36a只有T淋巴細(xì)胞可以產(chǎn)生，是一些具有生物活性的分子。IL-36與特異性受體IL-36R結(jié)合后才能促進(jìn)炎癥的發(fā)展，IL-36Ra是IL-36的天然受體拮抗劑。IL-36、IL-36R、IL-36Ra主要表達(dá)于皮膚、氣管等上皮組織中，IL-36γ多表達(dá)于子宮中，IL-36α多表達(dá)于胸腺中，IL-36β多表達(dá)于關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞、滑膜組織及骨骼肌角質(zhì)細(xì)胞中等[12]。有研究指出，IL-36分子在皮膚中的表達(dá)更為顯著，與銀屑病的發(fā)生發(fā)展有著緊密的聯(lián)系，銀屑病患者皮損中IL-36及IL-36R高表達(dá)，與健康人或患者未受損皮膚相比顯著偏高。IL-38原名IL-1F10，是IL-36的5個(gè)受體拮抗體之一，在人體免疫組織中的表達(dá)較為廣泛，在扁桃體B淋巴細(xì)胞和皮膚中表達(dá)更為顯著，在心臟等無(wú)免疫功能的組織中表達(dá)不明顯[13,14]。相關(guān)研究證明，IL-38與IL-36Ra具有相似的生物學(xué)作用，均是通過(guò)抑制IL-36與IL-36R相結(jié)合從而產(chǎn)生抗炎作用。

本文研究中，不同病情分級(jí)銀屑病患者性別、年齡無(wú)明顯差異（P＞0.05），說(shuō)明尋常性銀屑病病情嚴(yán)重程度與患者年齡、性別不存在明顯關(guān)聯(lián)。銀屑病患者血清IL-36、IL-36Ra及IL-38水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），中重度患者指標(biāo)水平顯著高于輕度患者（P＜0.05），由此表明銀屑病病情越嚴(yán)重，外周血血清IL-36α、IL-36β、IL-36γ表達(dá)水平越高，IL-36Ra和IL-38表達(dá)水平越低，IL-36、IL-36Ra及IL-38或可作為銀屑病患者重要的外周血標(biāo)志物。IL-36α（P=0.002）、IL-36β（P=0.002）、IL-36γ（P=0.003）水平與PASI評(píng)分呈正相關(guān)，IL-36Ra、IL-38水平與PASI評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，表明IL-36、IL-36Ra及IL-38表達(dá)水平與PASI存在顯著的線性相關(guān)性。

相關(guān)研究指出，IL-36主要分布在皮膚、支氣管上皮和腦組織中，通過(guò)與受體復(fù)合體合作作用于上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞等。IL-36通過(guò)誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子、抗菌肽、趨化因子等促進(jìn)炎癥反應(yīng)以抵御外界病原微生物，同時(shí)由于促炎性細(xì)胞因子及趨化因子等釋放，誘發(fā)銀屑病等自身免疫性疾病或免疫相關(guān)的炎癥性疾病，其表達(dá)水平的高低與銀屑病的發(fā)生、發(fā)展及病情程度存在緊密聯(lián)系[15]。楊曉娥[16]在其研究中指出，不同病情嚴(yán)重程度的尋常性銀屑病患者血清IL-36γ 、IL-36β、IL-36α和IL-36Ra水平存在顯著差異，中重度患者 IL-36γ 、IL-36β、IL-36α 水平明顯高于輕度患者，IL-36Ra水平明顯低于輕度患者，說(shuō)明IL-36和IL-36Ra水平與銀屑病的病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)，本文結(jié)論與其一致。

綜上所述，尋常性銀屑病患者血清IL-36、IL-36Ra及IL-38表達(dá)水平與銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)存在緊密的聯(lián)系，具有一定的相關(guān)性，可以為銀屑病臨床診斷、治療及病情分析提供參考。