紅花黃色素對動脈粥樣硬化大鼠內(nèi)皮功能、炎癥反應、氧化應激的影響

劉淑玲 蔡海榮 陳燕虹 莊杰欽 蔡鑫桂 張烈元 張為章 陳伯鈞

(廣州中醫(yī)藥大學 1第二附屬醫(yī)院急診科，廣東 廣州 510120；2第二臨床醫(yī)學院)

內(nèi)皮功能障礙、炎癥因子和氧化應激是動脈粥樣硬化形成的主要機制〔1～5〕。注射用紅花黃色素由紅花提取而成，其主要成分是羥基紅花色素A，臨床治療動脈粥樣硬化性疾病具有明顯的療效，但是關于其機制尚不完全明確〔6〕。本實驗探討紅花黃色素對動脈硬化大鼠一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素(ET)-1、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、活性氧(ROS)、腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6、IL-8、單核細胞趨化蛋白(MCP)-1的影響，初步揭示紅花黃色素對動脈硬化大鼠的干預機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SD大鼠，64只，雌雄各半，SPF級，6～8周齡，體重160～180 g，由北京隆安實驗動物養(yǎng)殖中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2014-0003，使用許可證號：SYXK(京)2014-0040。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫：20～25℃，濕度：40%～50%，光照：9∶00～21∶00。高脂飼料：87.3%基礎飼料，10.0%豬油，0.2%丙硫氧嘧啶，0.5%膽酸鈉，2.0%膽固醇；高脂飼料和基礎飼料由廣州市白云區(qū)龍歸興科動物養(yǎng)殖場提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2017-0042。

1.2藥品、試劑和儀器 注射用紅花黃色素(浙江永寧藥業(yè)股份有限公司，國藥準字：Z20050146，規(guī)格：50 mg/瓶，批號：20170624)；阿托伐他汀鈣片(輝瑞制藥有限公司，國藥準字：H20051407，規(guī)格：10 mg/片，批號：20170924)；生理鹽水(北京費森尤斯卡比醫(yī)藥有限公司，國藥準字：H20033558，規(guī)格：100 ml∶0.9 g，批號：20170318)；NO、ET-1酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒〔上海晶抗生物工程有限公司，批號分別為JK-(a)-1629、BIO-JK61123〕；MDA、SOD、GSH-Px ELISA 試劑盒(武漢純度生物科技有限公司，批號：111285、111144、109048)；ROS ELISA 試劑盒(上海通蔚實業(yè)有限公司，批號：12508)；IL-6、MCP-1、IL-8、TNF-α ELISA試劑盒(上海廣銳生物科技有限公司，批號：154、106、083、092)；ML54T/00電子分析天平(梅特勒-托利多國際有限公司)；JIDI-20R臺式多用途高速冷凍離心機(廣州吉迪儀器有限公司)。

1.3模型建立及給藥 選用SD大鼠64只，適應性喂養(yǎng)1 w后，隨機分為對照組(16只)和造模組(48只)。采用高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合維生素D3腹腔注射方法建立動脈粥樣硬化大鼠模型〔7〕，造模組給予高脂飼料喂養(yǎng)，并在造模第1天經(jīng)腹腔一次性注射維生素D3(60×104IU/kg)，對照組給予基礎飼料喂養(yǎng)，并在造模第1天經(jīng)腹腔一次性注射等量的生理鹽水。兩組大鼠一共喂養(yǎng)8 w。8 w后，將造模組大鼠隨機分為模型組、紅花黃組和他汀組，每組16只。紅花黃組給予注射用紅花黃色素15.75 mg/(kg·d)；對照組和模型組給予等體積的生理鹽水腹腔注射；他汀組給予阿托伐他汀1.05 mg/(kg·d)加生理鹽水配置成0.1 mg/ml溶液灌胃。繼續(xù)喂養(yǎng)8 w，末次給藥禁食16 h后處死。

1.4實驗室指標的檢測 將胸主動脈取出后，生理鹽水沖洗干凈，稱取2 g加入生理鹽水，4℃研磨制成10%勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液，采用ELISA法檢測胸主動脈NO、ET-1、MDA、SOD、GSH-Px、ROS、IL-6、MCP-1、IL-8、TNF-α水平。

1.5統(tǒng)計學方法 運用SPSS24.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組胸主動脈NO、ET-1的變化 第8周，與對照組比較，模型組、紅花黃組和他汀組NO水平明顯降低(P<0.05)，ET-1水平明顯升高(P<0.05)；第16周，與對照組比較，模型組NO水平明顯降低(P<0.05)，ET-1水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，紅花黃組NO水平明顯升高(P<0.05)，ET-1水平明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組胸主動脈NO、ET-1的變化

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05;下表同

2.2各組胸主動脈MDA、SOD、GSH-Px、ROS的變化 第8周，與對照組比較，模型組、紅花黃組和他汀組MDA、ROS水平明顯升高(P<0.05)，SOD、GSH-Px水平明顯降低(P<0.05)；第16周，與對照組比較，模型組MDA、ROS水平明顯升高(P<0.05)，SOD、GSH-Px水平明顯降低(P<0.05)，與模型組比較，紅花黃組MDA、ROS水平明顯降低(P<0.05)，SOD、GSH-Px水平明顯升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組胸主動脈MDA、SOD、GSH-Px、ROS的變化

2.3各組胸主動脈IL-6、MCP-1、IL-8、TNF-α的變化 第8周，與對照組比較，模型組、紅花黃組和他汀組IL-6、MCP-1、IL-8、TNF-α水平明顯升高(P<0.05)；第16周，與對照組比較，模型組IL-6、MCP-1、IL-8、TNF-α水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，紅花黃組IL-6、MCP-1、IL-8、TNF-α水平明顯降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組胸主動脈IL-6、MCP-1、IL-8、TNF-α的變化

3 討 論

隨著社會進步和生活方式的改變，動脈粥樣硬化的發(fā)病率呈現(xiàn)上升和年輕化的趨勢，動脈粥樣硬化是心腦血管疾病最重要的病理基礎，可以引起腦卒中、心肌梗死等心腦血管疾病，因此，積極治療動脈粥樣硬化對防治心腦血管疾病具有重要的意義。內(nèi)皮功能損傷、炎癥反應和氧化應激反應在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用〔8〕，雖然高脂血癥、高血壓等是動脈粥樣硬化的危險因素，但是內(nèi)皮損傷和炎癥反應是動脈粥樣硬化的起始環(huán)節(jié)。炎癥學說認為動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥疾病，在動脈粥樣硬化早期，血管發(fā)生內(nèi)皮損傷，即有大量中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞浸潤在血管壁〔9〕，這些炎癥細胞可以分泌大量炎癥因子〔10〕，IL-6可以促進血管細胞外基質(zhì)的降解，引起斑塊不穩(wěn)、破裂，是反應動脈粥樣硬化進程的重要標志物〔11〕。IL-8是一種促血管生成因子，可以促進平滑肌細胞的增殖和遷移，也可以刺激巨噬細胞聚集堆積在血管內(nèi)皮〔12〕。TNF-α可以促進平滑肌細胞增殖、抑制纖溶系統(tǒng)活性〔13〕。IL-6、IL-8、TNF-α可以刺激巨噬細胞分泌大量的MCP-1，MCP-1可以促進單核細胞等炎癥細胞聚集在血管內(nèi)膜，促進動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。氧化應激可以通過產(chǎn)生大量的氧自由基，發(fā)生氧化反應，引起內(nèi)皮損傷，ROS可以反映集體氧自由基的總量，MDA可以反映機體脂質(zhì)過氧化的程度，SOD和GSH-Px可以清除氧自由基。若機體內(nèi)ROS、MDA過多，SOD、GSH-Px過少，可以導致血管內(nèi)皮發(fā)生氧化損傷，促進動脈粥樣硬化〔14，15〕。NO、ET-1是反映機體內(nèi)皮功能紊亂的重要標志物，均由血管內(nèi)皮產(chǎn)生，NO具有舒張血管、抑制平滑肌增殖等作用〔16〕，ET-1具有收縮血管、促進平滑肌細胞遷移等作用〔17〕，NO/ET-1的失衡可以引起血管內(nèi)皮功能紊亂，導致動脈粥樣硬化。

動脈粥樣硬化屬于中醫(yī)學“痰濁”范疇〔18〕，紅花黃色素由紅花提取而成，主要成分為羥基紅花黃色素A，臨床治療動脈粥樣硬化性疾病具有明顯的療效〔6〕。本實驗結果提示炎癥反應、氧化應激和內(nèi)皮功能紊亂在動脈粥樣硬化的進程中起到了一定的作用；紅花黃色素可能通過調(diào)控內(nèi)皮功能、炎癥反應和氧化應激反應延緩動脈粥樣硬化。