音樂療法對阿爾茨海默病小鼠空間學習記憶能力及神經(jīng)免疫炎性因子的影響

祁欣 孟爽 汪偉

(長春大學 1音樂學院，吉林 長春 130022；2特殊教育學院)

阿爾茨海默病(AD)是一種常見的老年退行性神經(jīng)性疾病，又稱為老年性癡呆，臨床一般表現(xiàn)為學習障礙、記憶障礙、注意障礙、空間認知功能、問題解決能力障礙，嚴重者生活無法自理，病情惡化后還可見被害、妄想、幻覺等癥狀〔1，2〕。隨著人口老齡化加重，AD的發(fā)病率及患病率有逐漸上升趨勢〔3〕。音樂治療是運用音樂活動的各種形式和手段，通過刺激、催眠、激發(fā)患者身體反應(yīng)達到治療目的的一種治療方式；在國外，音樂療法尤其是AD應(yīng)用音樂治療已有70多年的歷史〔1,4～6〕，治療效果值得肯定。本實驗探討音樂治療對AD小鼠空間記憶能力、腦海馬中神經(jīng)免疫炎性因子白細胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α的蛋白陽性表達強度及IL-1β、IL-6、TNF-α、5-羥色胺(HT)和去甲腎上腺素(NE)mRNA水平的影響，旨在為AD音樂療法的臨床輔助神經(jīng)免疫治療提供重要的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動物分組及治療方式 選取野生C57BL/6雌性小鼠和APP/V717轉(zhuǎn)基因雌性小鼠作為研究對象，體重(23.4±1.2)g，由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供，合格證SCXK(遼)2015-0001。分為對照組(C57BL/6野生雌性小鼠，n=10)、AD模型組(APP/V717轉(zhuǎn)基因雌性小鼠，n=10)和音樂治療組(APP/V717轉(zhuǎn)基因雌性小鼠，n=10)，三組均給予正常飲食。音樂治療組每天早、中、晚各一次給予音量40～65分貝(dB)舒緩、輕柔的音樂30 min，共治療12 w。

1.2試劑及儀器 鼠抗IL-1β、IL-6、TNF-α抗體購于Abcam公司；SP9710和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購于福州邁新生物技術(shù)有限公司；Trizol購于Invitrogen公司；Taq酶、DL 2000 marker和RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Takara公司；IL-1β、IL-6、TNF-α、5-HT和NE引物由上海生物工程有限公司提供。實時熒光定量PCR儀(ABI7300，Biotek公司，美國)；Biometra PCR擴增儀(Biotek公司，美國)；Morris水迷宮(Panlab公司，西班牙)；Olympus BX51顯微鏡(Olympus公司，日本)。

1.3實驗標本采集和檢測指標

1.3.1各組小鼠空間記憶能力 在實驗結(jié)束前5 d，通過Morris水迷宮連續(xù)訓練4 d，第5天測試逃避潛伏期、經(jīng)過平臺次數(shù)和平臺象限停留時間，觀察小鼠記憶能力是否有改善。

1.3.2各組小鼠腦海馬神經(jīng)細胞損傷程度 三組小鼠在實驗12 w結(jié)束后，處死取腦組織，常規(guī)石蠟包埋，制備5 μm切片1張，采用蘇木精-伊紅(HE)染色，在普通光學顯微鏡下觀察腦海馬神經(jīng)細胞損傷程度并攝取圖片。

1.3.3各組小鼠腦海馬中IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白陽性表達強度 制備3 μm石蠟切片3張，采用免疫組織化學染色觀察IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白陽性表達強度，陽性表達呈棕褐色，細胞核用蘇木精復染。通過Motic Images Advanced3.2圖像分析軟件觀察200倍鏡下連續(xù)5個視野，測定各組腦海馬中IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白陽性表達強度的光密度值(OD值)；OD值越大陽性表達越強。

1.3.4各組小鼠腦組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、5-HT和NE mRNA水平 Trizol提取腦組織總RNA，每個樣本基因擴增3次，行實時熒光定量PCR檢測IL-1β、IL-6、TNF-α、5-HT和NE的mRNA水平，取Ct值均值，采用2-ΔΔCt表示目的基因相對表達水平。

1.4統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組腦海馬神經(jīng)細胞損傷程度比較 HE染色鏡下可見：對照組腦組織神經(jīng)細胞胞質(zhì)飽滿，細胞核大、核仁清晰，細胞周隙??；模型組腦組織神經(jīng)細胞明顯空化，細胞核固縮壞死明顯，細胞周隙較大；音樂治療組腦組織神經(jīng)細胞空化輕微，細胞核固縮壞死較模型組明顯減少。

2.2各組逃避潛伏期、經(jīng)過平臺次數(shù)和平臺象限停留時間比較 與對照組比較，模型組逃避潛伏期明顯延長、經(jīng)過平臺次數(shù)明顯減少，平臺象限停留時間明顯縮短(P<0.05)。音樂治療組逃避潛伏期較對照組略延長(P>0.05)，但較模型組明顯縮短(P<0.05)；經(jīng)過平臺次數(shù)較對照組略減少、平臺象限停留時間略縮短(P>0.05)，但較模型組均明顯延長(P<0.05)。見表1。

2.3各組腦海馬中IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白陽性表達強度比較 與對照組比較，模型組、音樂治療組IL-1β、IL-6、TNF-α的蛋白陽性表達強度均明顯增高(P<0.05)； 與模型組比較，音樂治療組IL-1β、IL-6、TNF-α的蛋白陽性表達強度均明顯降低(P<0.05)。見表2、圖1。

表1 各組逃避潛伏期、經(jīng)過平臺次數(shù)和平臺象限停留時間比較

與對照組比較：1)P<0.05;與模型組比較：2)P<0.05；下表同

表2 各組腦海馬中IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白陽性表達強度比較值)

圖1 各組小鼠腦海馬免疫組織化學染色(×200，免疫組化SP染色)

2.4各組腦組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、5-HT和NE的mRNA水平比較 與對照組比較，模型組、音樂治療組IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA水平均明顯升高(P<0.05)，5-HT和NE mRNA水平均明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，音樂治療組IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA水平明顯降低(P<0.05)，5-HT和NE mRNA水平明顯升高(P<0.05)。見表3。

表3 各組腦組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、5-HT和NE的mRNA水平

3 討 論

音樂普遍存在于人們的日常生活，它能通過大腦內(nèi)在獎賞系統(tǒng)的假定刺激鼓舞精神、激活大腦和舒緩疲憊〔7〕。近年來隨著社會的進步、人民生活水平的提高，有著悠久歷史的音樂療法作為醫(yī)學邊緣交叉學科，逐步得到了廣泛的應(yīng)用、發(fā)展和認可。AD是德國醫(yī)生阿爾茨海默最先發(fā)現(xiàn)的一種腦神經(jīng)疾病，其臨床表現(xiàn)主要是記憶、智力、情感、認知行為、判斷力失常，甚至發(fā)生意識模糊這些進行性精神狀態(tài)衰變〔8〕。最為權(quán)威的美國著名音樂治療家Bruscia在他的《音樂治療定義》一書指出，特定的音樂對放松身心、振作精神、誘發(fā)睡眠等有實效，能提高機體學習記憶能力、抗疲勞、抗衰老〔9〕。本研究結(jié)果說明音樂療法能明顯改善AD小鼠的空間學習記憶能力。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)遞質(zhì)5-HT廣泛存在于大腦皮層中，是一種具有典型抑制性的神經(jīng)遞質(zhì)，對腦區(qū)的情感、睡眠、學習、記憶都有系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用〔10〕。本研究結(jié)果表明音樂治療組小鼠腦組織中5-HT mRNA水平較模型組明顯升高，這與5-HT活性增高能明顯改善AD患者記憶力相一致〔11〕，進一步證實了音樂療法對AD小鼠空間學習記憶能力的治療效果。

AD主要病理改變是老年斑、腦組織萎縮和神經(jīng)纖維纏結(jié)，它是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的退行性病變，發(fā)病機制還不清楚〔12〕。AD患者共有的病變是不同程度的炎癥反應(yīng)和膽堿能神經(jīng)通路受損。以往研究檢測深部腦電波圖顯示，音樂刺激后腦內(nèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)許多結(jié)構(gòu)都參與活動，不同音樂刺激在大腦海馬區(qū)產(chǎn)生不同波形〔12，13〕。大量研究證實中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的免疫炎性細胞(小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞)參與的免疫炎性反應(yīng)與AD的發(fā)病和進展密切相關(guān)，發(fā)揮主要作用的炎性因子有IL-1β、IL-6及TNF-α等〔14〕。IL-1β是IL-1多功能免疫調(diào)節(jié)細胞因子的一種，在細胞和體液免疫中起始動作用，它由細胞釋放出來作用于其他細胞發(fā)揮效應(yīng)，如果過度表達會導致營養(yǎng)障礙型軸突無意義的生長，形成大量老年斑，同時形成的大量一氧化氮還會損傷神經(jīng)元〔12,15〕。IL-6主要是由單核細胞或者巨噬細胞產(chǎn)生的一種糖蛋白，參與急性炎性反應(yīng)，它的生物學活性通過其受體IL-6R介導，IL-6過度表達形成β淀粉樣蛋白的沉積，后者又促進老年斑的形成，這種級聯(lián)反應(yīng)是AD重要的致病因素〔12,16〕。TNF-α是β淀粉樣蛋白刺激后由小膠質(zhì)細胞也就是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的巨噬細胞產(chǎn)生的神經(jīng)毒素，它的過度表達會對神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用，在腦內(nèi)神經(jīng)元損傷中扮演重要角色〔12,17〕。本研究結(jié)果表明音樂療法能有助于緩解AD小鼠的炎癥反應(yīng)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中NE是內(nèi)源性抗炎因子，它能抑制小膠質(zhì)細胞的活化與增殖〔18〕；本研究結(jié)果提示音樂療法促進NE分泌，能有效抑制炎癥反應(yīng)。

綜上所述，音樂對AD小鼠有一定的治療作用，也證明了音樂對神經(jīng)免疫功能的作用，為AD音樂療法的臨床輔助神經(jīng)免疫治療提供了重要實驗依據(jù)。