基質血管碎片凝膠對移植脂肪組織存活率的影響

傅金萍 朱飛

(安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院整形外科，安徽 合肥 230022)

自體脂肪顆粒作為一種軟組織填充材料在整形美容外科應用多年，但自體脂肪顆粒移植因低存活率、高吸收率及多并發(fā)癥使其在臨床進一步發(fā)展中受到限制〔1〕。因此大量學者試圖通過改善抽吸方式、脂肪移植獲取部位、注射移植、處理環(huán)節(jié)等方面的技術提高脂肪移植的存活率，但脂肪移植后壞死、吸收、液化等并發(fā)癥仍存在，使脂肪移植的存活率不穩(wěn)定〔2〕。血管再生在脂肪移植中發(fā)揮重要作用，提高移植脂肪組織早期血管再生對提高脂肪移植的存活率具有重要意義〔3〕?；|血管碎片凝膠(SVF-GEL)為一種新型的脂肪組織來源的干細胞凝膠，富含血管內皮細胞、脂肪干細胞和其他細胞等，具有促進創(chuàng)傷愈合的作用〔4〕；SVF-GEL還可有效逆轉膠原流失、皮膚衰老等帶來的黑眼圈、頸紋、眼周細紋、口周細紋等，可改善皮膚質地，促進皮膚年輕化。本文將SVF-GEL聯(lián)合脂肪顆粒進行脂肪移植，觀察SVF-GEL對脂肪移植存活率的影響。

1 材料與方法

1.1材料 實驗動物：健康、清潔級、體重22～24 g、7～9周齡、雄性、BALB/c裸鼠96只，購自馬鞍山豐原制藥有限公司，許可證號：SYXK(皖)2016-002。脂肪收集：從健康、沒有系統(tǒng)性疾病、要求抽脂塑身的女性大腿內側抽吸脂肪組織，受試者簽署知情同意書，該研究通過安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批。主要試劑：酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(美國Abcam公司)，兔抗大鼠CD34多克隆抗體、兔抗大鼠Perilipin A多克隆抗體、Cy3標記山羊抗兔抗體、山羊抗兔IgG抗體(美國Gibco公司)等。

1.2SVF-GEL制備：采用20 ml注射器連接抽吸針頭抽取受試者大腿內側脂肪組織，放入20 ml注射器中，放置在支架上靜置10 min，脂肪分為三層，放掉最下層血水混合物，再放掉血，留上層脂肪組織，將裝有脂肪的注射器放入離心機中離心(1 200 r/min)3 min，離心后注射器中的脂肪依次從上到下為三層，放掉最下層血水混合物，剩下上面兩層，最上面一層為低密度脂肪和油滴，第二層為高密度脂肪，取出高密度脂肪放入新的注射器做容量填充用，將低密度脂肪和油滴層做脂肪干細胞膠用。將提取的低密度脂肪和油滴通納米轉換器A頭和B頭來回對推10次，放入離心機中離心(1 600 r/min)5 min，離心后，取出注射器，得到油脂和干細胞膠，注射器最上方為油脂層，最下方為干細胞膠，將最下方的干細胞膠取出置入新注射器備用，制做完畢。

脂肪顆粒制備：用20 ml注射器連接抽吸針頭抽吸受試者大腿內側脂肪組織，靜置10 min，除去血性液體，裝入10 ml離心管中離心(1 200 r/min)3 min，去除上層油和底層液體，得到的即為脂肪顆粒。

1.3大鼠分組及處理 將96只大鼠根據(jù)隨機數(shù)字法分為SVF-GEL組和對照組，每組48只，SVF-GEL組大鼠移植0.3 ml脂肪顆粒和0.1 ml SVF-GEL；對照組大鼠移植0.3 ml脂肪顆粒和0.1 ml生理鹽水。具體步驟為：SVF-GEL組將0.3 ml脂肪顆粒和0.1 ml SVF-GEL加入1 ml注射器中備用，對照組將0.3 ml脂肪顆粒和0.1 ml生理鹽水加入1 ml注射器中備用；實驗裸鼠用碘伏消毒，將上述裝有移植混合物的注射器連接無菌注射針頭注射進各組對應裸鼠背部左右肩胛處皮下相同位置，注射后針眼處涂抹金霉素軟膏。

1.4移植脂肪組織中血管內皮生長因子(VEGF)水平測定 術后2 w，每組取12只大鼠，取大鼠移植脂肪組織，充分勻漿，采用ELISA測定移植脂肪組織VEGF水平。

1.5移植脂肪組織中血管數(shù)量測定 術后2 w，每組取12只裸鼠，取移植脂肪組織，多聚甲醛固定，石蠟包埋，切成5 μm厚切片。采用CD34免疫組化染色觀察移植脂肪組織血管數(shù)量。將移植脂肪組織石蠟切片經烤片、脫蠟至水，加入過氧化氫孵育10 min去除內源性過氧化物酶活性，加入檸檬酸鈉微波修復5 min，共2次，加入山羊血清孵育30 min封閉非特異染色位點，加入一抗：兔抗大鼠CD34抗體(1∶100)過夜孵育，加入山羊抗兔抗體二抗(1∶200)孵育1 h，加入蘇木素孵育5 min染色細胞核，脫水，封片，拍照，計算每個高倍視野微血管數(shù)量。染色成黑褐色管狀的為微血管。

1.6移植脂肪組織中脂肪細胞活力檢測 采用Perilipin A免疫熒光法測定移植脂肪細胞存活率和小脂肪細胞數(shù)量：將石蠟切片脫蠟至水，加入雙氧水孵育10 min去除內源性過氧化物酶活性，加入檸檬酸鈉微波修復5 min，共2次，加入山羊血清孵育30 min封閉非特異染色位點，加入一抗：兔抗大鼠Perilipin A抗體(1∶200)過夜孵育，加入Cy3標記山羊抗兔抗體二抗(1∶100)孵育1 h，加入DAPI孵育30 min染色細胞核，封片，拍照，計算每個高倍視野存活脂肪細胞數(shù)量。Perilipin A陽性細胞為活的脂肪細胞，Perilipin A染色中小、高亮的脂肪細胞為活力更強的脂肪細胞。

1.7長期脂肪成活質量 術后12 w，每組取12只大鼠，取移植脂肪組織，多聚甲醛固定，進行常規(guī)HE染色，觀察移植脂肪組織存活情況。評價方法：包括炎癥細胞浸潤、纖維化、囊泡3個評價參數(shù)，每個評價參數(shù)程度分為0～5共6個等級，無為0，少量為1，比中量少為2，中量為3，比中量多為4，大量為5，計算3個評價參數(shù)評分。

1.8移植脂肪組織長期體積存活率 術后12 w時，每組取12只大鼠，取移植脂肪組織，放入2.5 ml注射器(含有1 ml生理鹽水)中，計算移植脂肪組織放入前后體積差值，即為移植脂肪組織的體積。脂肪組織體積存活率=12 w時脂肪體積/移植時脂肪體積×100%。

1.9統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1兩組移植脂肪組織中VEGF水平和血管數(shù)量比較 術后2 w時，SVF-GEL組移植脂肪組織中VEGF水平和血管數(shù)量明顯高于對照組(P<0.05)，見表1和圖1。

表1 兩組移植脂肪組織中VEGF水平比較

箭頭標注為微血管圖1 術后2 w兩組脂肪組織中CD34 免疫組化染色(×400)

2.2兩組移植脂肪組織中脂肪細胞存活率和小脂肪細胞數(shù)量比較 SVF-GEL組移植脂肪組織中脂肪細胞存活率和小脂肪細胞數(shù)量明顯高于對照組(P<0.05)，見表2和圖2。

2.3兩組長期脂肪成活質量比較 術后12 w HE染色顯示：SVF-GEL組炎癥細胞較少，脂肪細胞大小比較均勻，囊泡少，纖維間隔少；對照組可見較多炎癥細胞，脂肪細胞大小不等，囊泡和纖維間隔較多。SVF-GEL組大鼠炎癥評分、纖維化評分和囊泡評分均明顯低于對照組(P<0.05)，見表3和圖3。

2.4兩組移植脂肪組織長期體積存活率比較 SVF-GEL組大鼠移植脂肪組織長期體積存活率〔(54.16±7.18)%〕明顯高于對照組〔(32.14±6.37)%,t=7.947,P=0.000〕。

表2 兩組移植脂肪組織中脂肪細胞存活率和小脂肪細胞數(shù)量比較

Perilipin A陽性細胞為存活的脂肪細胞，箭頭標注的為染色強陽性、圓形、體積小的小脂肪細胞圖2 術后2 w兩組脂肪組織Perilipin A免疫熒光染色(×400)

表3 兩組大鼠炎癥評分、纖維化評分和囊泡評分比較

圖3 術后12 w兩組脂肪組織HE染色(×400)

3 討 論

自體脂肪移植已有百余年的歷史了，最早移植的脂肪組織為塊狀脂肪，隨著脂肪抽吸技術的發(fā)展，自體顆粒脂肪注射在脂肪移植中廣泛應用〔5〕。因顆粒脂肪取材方便、來源廣泛、可長期存在、無免疫排斥反應、外觀和質感自然、手術損傷小等優(yōu)點，使其在臨床應用中優(yōu)于生物填充材料，在軟組織缺損或凹陷的填充中被廣泛應用，尤其在隆乳手術和面部抗衰老中應用更為廣泛〔6～8〕。顆粒脂肪在抗皮膚衰老方面可保護膠原蛋白、促進修復并分泌膠原蛋白、維護皮膚健康、促進皮膚細胞更新等，從而在皮膚年輕化方面發(fā)揮重要作用。但由于移植脂肪組織的吸收率比較高，因此一般需要多次手術才可得到滿意效果，且移植后容易出現(xiàn)壞死、液化、硬結、囊腫、鈣化等并發(fā)癥，使其在脂肪移植中的應用前景受到限制〔9～11〕。因此減少脂肪移植后液化壞死、提高脂肪移植存活率具有重要意義。

移植脂肪的高吸收率和早期血管化不足關系密切。脂肪組織具有葡萄串樣的空間結構，每個脂肪細胞有相應的單個血管供應，因此脂肪組織血液供應比較豐富，可保證其有充足的養(yǎng)分供應〔12〕。在顆粒脂肪的抽吸過程、收集過程及注射過程中，脂肪組織及其血管供應系統(tǒng)遭到破壞，僅留有少量血管片段〔13，14〕。研究發(fā)現(xiàn)脂肪移植早期主要靠組織間隙滲透作用維持營養(yǎng)供應，但這種滲透范圍比較小，只有在這小范圍內移植的脂肪組織可以存活，從而使脂肪移植早期脂肪組織的存活受到限制〔15〕。因此促進脂肪移植早期的血管化進程可為早期脂肪細胞提供養(yǎng)分和氧供，提高脂肪移植存活率。

SVF-GEL為采用簡單的物理方法將抽吸脂肪組織去油而得到，是脂肪干細胞和脂肪組織中細胞外基質的原生態(tài)生理結合物，10 ml脂肪組織科提取1 ml SVF-GEL，其外觀為呈類似透明質酸的凝膠狀〔16〕。SVF-GEL富含血管內皮細胞、脂肪來源干細胞及其他細胞等。將SVF-GEL用于裸鼠創(chuàng)面，可促進裸鼠創(chuàng)面修復〔17〕。SVF-GEL在抗衰老方面可增加皮膚膠原蛋白，修復因衰老而導致的膠原蛋白斷裂，增加皮膚光澤度使皮膚紅潤，改善頸紋、額紋、魚尾紋、口周紋等局部細紋，淡化日曬斑、黃褐斑、雀斑等色斑，緊致皮膚、保持皮膚健康狀態(tài)、減緩皮膚衰老等。移植脂肪可因組織缺血引起脂肪細胞死亡，脂肪細胞死亡后發(fā)出級聯(lián)信號刺激脂肪干細胞，導致脂肪干細胞釋放成血管因子，并分化為血管內皮細胞和新的脂肪細胞，表明脂肪干細胞可分化為新的脂肪細胞代替死亡脂肪細胞，還可促進血管生成，改善血液供應，從而提高移植脂肪的存活率。SVF-GEL因富含血管內皮細胞和脂肪干細胞及細胞外基質，這些成分均有利于血管化和成脂化。

本研究結果表明SVF-GEL可通過促進移植脂肪組織血管生成，提高移植脂肪組織活性和長期體積存活率。