D-半乳糖/亞硝酸鈉誘導(dǎo)癡呆小鼠大腦海馬組織中CX43、MMP-2、MMP-9的mRNA及蛋白表達(dá)

黃仕美 楊小蓉 羅亞 汪忠保 汪元河

(1貴州醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)臨床學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550004；2貴州省黔西縣公安局)

老年性癡呆癥又叫阿爾茨海默病(AD)，該病的主要根源是神經(jīng)退行性改變，此類(lèi)患者在行為上會(huì)表現(xiàn)出記憶能力變差、智力退化、性格和精神失常、與社會(huì)環(huán)境格格不入〔1〕。在外觀上的表現(xiàn)為老年斑、因持續(xù)累積的tau 蛋白過(guò)度磷酸化形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFT)及β-淀粉樣蛋白(Aβ)增加〔2〕。該疾病的病因及怎樣有效預(yù)防和治療暫時(shí)還沒(méi)有達(dá)成共識(shí)。鋅依賴(lài)性肽鏈內(nèi)切酶類(lèi)中，對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白產(chǎn)生降解作用的是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括帕金森病(PD)及AD在內(nèi)，其形成都與MMPs相關(guān)。該類(lèi)酶將對(duì)應(yīng)的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)進(jìn)行分解，在各類(lèi)細(xì)胞的病理及生理活動(dòng)中對(duì)重組及水解兩個(gè)過(guò)程的平衡進(jìn)行作用。此外，在人體出現(xiàn)炎癥時(shí)，MMPs的作用也是不可或缺的〔3，4〕。從神經(jīng)毒性來(lái)說(shuō)，Aβ和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)存在著極大關(guān)聯(lián)。不僅如此，Aβ代謝活動(dòng)在AD 患者體內(nèi)所維持的平衡狀態(tài)會(huì)隨相關(guān)金屬離子的狀態(tài)受 MMP-2作用產(chǎn)生的變化而發(fā)生改變，若AD所產(chǎn)生的作用存在于相關(guān)過(guò)程中，則該蛋白的活力水平必定會(huì)發(fā)生改變〔5〕。目前，基本上還沒(méi)有研究得出在AD的形成和治療過(guò)程中縫隙連接蛋白(CX)43和MMP-2、MMP-9的表達(dá)之間存在關(guān)聯(lián)。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性NIH小鼠40只，16～24 g。貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2試劑 D-半乳糖、亞硝酸鈉均為市售分析純；由上海生物工程有限公司設(shè)計(jì)生產(chǎn)MMP-9、CX43、MMP-2、β-actin定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的引物；DL2000 DNA Marker購(gòu)自日本TaKaRa公司；2×Taq PCR Master Mix購(gòu)自北京TIANGEN 公司；Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司；Firststart Universal SYBR Green Master(Rox)購(gòu)自德國(guó)Roche公司；RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Thermo公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜和超敏電化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Amer-sham公司；封閉液、抗體稀釋液、苯甲基磺酰氟(PMSF)蛋白酶抑制劑、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)配制試劑盒及5×蛋白上樣緩沖液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗CX43單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；兔抗MMP-2多克隆抗體、兔抗MMP-9多克隆抗體、兔抗β-肌紅蛋白(β-actin)單克隆抗體購(gòu)自上海Santa Cruz公司。

1.3動(dòng)物分組及藥物處理 小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組和模型組各10只。正常對(duì)照組皮下注射等體積生理鹽水，模型組皮下注射D-半乳糖(120 mg/kg)和亞硝酸鈉(90 mg/kg)，連續(xù)給藥60 d，建立癡呆小鼠模型〔6〕。完成注射后，將4%的0.2 ml/g水合氯醛注射進(jìn)腹腔進(jìn)行麻醉，剖開(kāi)胸面，露出心臟，由左心室一直延伸到主動(dòng)脈用穿刺針穿刺，使用40 ml pH=7.4的磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L)清潔血管床，持續(xù)5 min接著剝離大腦組織，-80℃儲(chǔ)存。

1.4實(shí)時(shí)熒光(RT)-PCR檢測(cè)β-actin、MMP-9、MMP-2及CX43 mRNA表達(dá)水平 用Trizol一步法，提取海馬組織中RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。β-actin、MMP-9、MMP-2及CX43對(duì)應(yīng)的引物序列見(jiàn)表1。采用ABI Step One Plus 型RT-PCR儀獲取β-actin、MMP-9、MMP-2及CX43的擴(kuò)增信號(hào)采用SDS2.1軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析及對(duì)熒光信息進(jìn)行獲取。β-actin為內(nèi)參對(duì)照，對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行分析，RQ=2-ΔΔCt，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 RT-PCR引物序列及產(chǎn)物片段

1.5Western印跡法檢測(cè)MMP-9、MMP-2及CX43蛋白表達(dá)水平 向PMSF：放射免疫沉淀(RIPA)裂解液=1∶100的比例放入海馬組織，冷凍離心機(jī)4℃、12 000 r/min離心20 min，取上清液檢測(cè)目標(biāo)蛋白質(zhì)。使用超微量紫外分光光度計(jì)N2000型檢測(cè)各樣品蛋白濃度，Image J軟件分析圖片灰度值，以β-actin蛋白為內(nèi)參，MMP9、MMP2、CX43的蛋白條帶相對(duì)內(nèi)參蛋白條帶灰度的比值為檢測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，重復(fù)3次。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

相比于正常對(duì)照組，模型組CX43、MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05，P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 兩組CX43、MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)水平

3 討 論

MMPs是一組降解細(xì)胞外基質(zhì)最主要的酶類(lèi)〔7〕，1962年，Lapiere和Gross首次發(fā)現(xiàn)，在多種內(nèi)膚酶中存在著一系列根據(jù)鋅離子相關(guān)狀況來(lái)發(fā)揮功能的蛋白酶，也就是MMPs，除了神經(jīng)元，還有許多不同類(lèi)型的細(xì)胞都能夠分泌此類(lèi)蛋白酶，如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等〔8〕。一般來(lái)說(shuō)，在人體傷口恢復(fù)和發(fā)育的過(guò)程中，MMPs所起到的作用是非常關(guān)鍵的，但若人體發(fā)生了某些疾病，MMPs所產(chǎn)生的作用對(duì)病情的發(fā)展十分不利，如AD或腦卒中等〔9，10〕。到目前為止，已有超過(guò)20種人體自帶的MMPs被發(fā)現(xiàn)〔11〕。

MMPs的種類(lèi)較多，其中所起到的影響最大的就是能夠?qū)羽みB蛋白、彈性蛋白及明膠等進(jìn)行分解的MMP-2和MMP-9，在發(fā)生水解后，神經(jīng)細(xì)胞會(huì)因?qū)羽みB蛋白的減少而遭到嚴(yán)重破壞甚至失活。研究表明，AD患者死亡后，解剖尸體發(fā)現(xiàn)MMP-9在大腦血管內(nèi)皮細(xì)胞及海馬體神經(jīng)元中呈高表達(dá)，因此神經(jīng)細(xì)胞難以實(shí)現(xiàn)膠原化。而在腦組織細(xì)胞中，MMP-2、MMP-9 的高表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，損害神經(jīng)元。Aβ屬于三磷酸腺苷(ATP)的分解產(chǎn)物，該物質(zhì)的降解可通過(guò)MMP-9來(lái)實(shí)現(xiàn)，這一點(diǎn)在體外實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)得到了驗(yàn)證，此外，髓鞘堿性蛋白及細(xì)胞外基質(zhì)也會(huì)在MMP-9的作用下被徹底分解，更加嚴(yán)重地破壞患者腦部組織〔8〕。信息交流在細(xì)胞中的實(shí)現(xiàn)主要依靠縫隙連接(GJ)，包括環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、三磷酸肌醇(IP3)及ATP在內(nèi)的部分小分子氨基酸等小分子物質(zhì)及離子等能夠穿過(guò)其中，該結(jié)構(gòu)由兩個(gè)半通道相連而成，主要物質(zhì)為CX，其具有特殊性質(zhì)。在血腦屏障精細(xì)結(jié)構(gòu)的組成中CX43是組成星形膠質(zhì)細(xì)胞縫隙的主要物質(zhì)，該類(lèi)結(jié)構(gòu)多存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中?？p隙的信息交流水平極大程度上取決于CX43的表達(dá)程度，這一點(diǎn)在包括骨髓損傷在內(nèi)的部分神經(jīng)病理性疼痛模型中有所體現(xiàn)〔12〕。

雖然NFT及老年斑因Aβ沉積而增多是引發(fā)AD的關(guān)鍵原因，但AD是一個(gè)多因素相互作用的疾病〔13〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示CX43及MMP-9表達(dá)紊亂在AD小鼠的發(fā)病機(jī)制中可能起著重要作用。