補(bǔ)腎益肝活血方含藥血清對ERK/p38MAPK信號通路的影響

許駿 謝林

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬省中西結(jié)合醫(yī)院骨傷科，江蘇 南京 210000)

骨關(guān)節(jié)炎(OA)屬于中醫(yī)學(xué)痹證的范疇，好發(fā)于老年人，以軟骨退變和關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)增生、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)代謝失調(diào)為主要的病理特征，軟骨變性是OA的最基本病理改變，臨床上表現(xiàn)為關(guān)節(jié)的疼痛、僵硬、肥大及功能活動受限等〔1〕。臨床上應(yīng)用補(bǔ)腎益肝活血方治療OA療效顯著，取得良好臨床效果，并通過實(shí)驗(yàn)探討了該方對軟骨細(xì)胞凋亡、骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)分化的影響，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎益肝活血方有抑制軟骨細(xì)胞凋亡的作用，其含藥血清能有效誘導(dǎo)BMSCs成軟骨細(xì)胞分化，其作用機(jī)制很可能與細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)存在相關(guān)聯(lián)系。本研究旨在分析補(bǔ)腎益肝活血方對OA ERK/p38MAPKs信號通路產(chǎn)生的影響，探究OA發(fā)生機(jī)制及OA治療中的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 選取健康的、成年SPF級雌性SD大鼠，重量185～230 g，實(shí)驗(yàn)用動物全部由南京中醫(yī)藥大學(xué)研究所提供。為了使這些大鼠適應(yīng)周圍環(huán)境，納入本實(shí)驗(yàn)的所有SD大鼠均于實(shí)驗(yàn)前1 w放置在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，飼養(yǎng)員進(jìn)行常規(guī)的分籠飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)室基本指標(biāo)：保持自然光照，良好的通風(fēng)，室內(nèi)溫度要求控制在18.5～23.0℃，濕度控制在40%～70%。實(shí)驗(yàn)研究期間，所有大鼠進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)顆粒詞料，并可以自由地飲用自來水，術(shù)前8 h禁食水。

1.1.2主要試劑、儀器與藥品 胎牛血清(FBS，Gibco公司)；DMEM低糖培養(yǎng)基(Hyclone公司)；雙抗混合液(100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素)，10%胰蛋白酶、0.2%Ⅱ型膠原酶(Sigma 公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas 公司)；引物合成(上海生工生物工程公司)；磷酸化-絲裂原活化蛋白激酶p38抗體(Anti-p-p38α，Thr180/Tyr182)一抗(Millipore 公司)；p38一抗(Millipore 公司)。二氧化碳培養(yǎng)箱、熒光倒置顯微鏡、流式細(xì)胞儀、酶標(biāo)儀、濾器、無菌操作臺和高速離心機(jī)。補(bǔ)腎益肝活血方由骨碎補(bǔ)15 g、丹參10 g、沒藥10 g及懷牛膝10 g組成，實(shí)驗(yàn)所用藥物由南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬省中西結(jié)合醫(yī)院藥劑科提供。

1.2實(shí)驗(yàn)動物分組 40只雌性 SD 大鼠隨機(jī)分為 4組，即對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組各 10只。

1.3補(bǔ)腎益肝活血方含藥血清的制備 根據(jù)人和動物間按體表面積折算的等效劑量比率表換算，給藥組給予補(bǔ)腎益肝活血方3.2 g/(kg·d)灌胃，對照組則給予等量的生理鹽水灌胃。各組每12 h灌胃給藥1次，連續(xù)灌胃 5 d。并在最后一次灌胃前禁食，末次灌藥3 h后，麻醉SD大鼠，行腹主動脈采血，靜置于溫度預(yù)調(diào)在4℃的冰箱4 h后，離心機(jī)設(shè)置2 500 r/min的轉(zhuǎn)速，離心25 min，分離離心所得血清，將同組實(shí)驗(yàn)動物分離所得到的血清予以混合，并在56℃水浴箱內(nèi)，滅活30 min，抽濾、除菌后分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)與鑒定

1.4.1軟骨細(xì)胞分離、原代培養(yǎng) 軟骨細(xì)胞分離步驟：①選取12只新生SD乳大鼠(48 h內(nèi))行脫頸法處死，浸泡75%乙醇5 min，放在無菌手術(shù)臺上；②用眼科剪和鑷子分離大鼠肋骨處的軟骨，分離以后，放入活力碘伏內(nèi)浸泡3 min；③準(zhǔn)備好培養(yǎng)皿，將浸泡好的軟骨轉(zhuǎn)移至超凈臺，將殘余軟組織剔除，轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿內(nèi)，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2遍，棄上清。軟骨細(xì)胞原代培養(yǎng)步驟：①第一次酶解：將清洗干凈的軟骨轉(zhuǎn)移到中號培養(yǎng)皿內(nèi)，加入10倍體積的0.2%Ⅱ型膠原酶；②用眼科剪將軟骨塊剪至1 mm以內(nèi)的小塊，使用移液器，將其充分混勻，使細(xì)胞分散后放置于二氧化碳培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度設(shè)為37℃，5%二氧化碳，在飽和濕度的條件下培養(yǎng)24 h；③軟骨塊消化至80%，取細(xì)胞懸液于離心管，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入8 ml完全培養(yǎng)基，細(xì)胞計數(shù)后以104接種于培養(yǎng)皿；④第二次酶解：培養(yǎng)達(dá)24 h后換液，此后每48 h換液一次，細(xì)胞傳代前使用倒置顯微鏡觀察，當(dāng)細(xì)胞面積達(dá)80%以上時，用10%的胰蛋白酶消化后進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.4.2軟骨細(xì)胞的鑒定 (1) 細(xì)胞形態(tài)觀察：每天在顯微鏡下對細(xì)胞的生長情況進(jìn)行觀察，使用胰蛋白酶將細(xì)胞消化為懸液以后取出50 ml，使用細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)后記錄，在1 w以內(nèi)不傳代。(2)甲苯胺藍(lán)染色：軟骨細(xì)胞內(nèi)的多聚糖可被甲苯胺特異性的染色，因此軟骨細(xì)胞的鑒定通常都使用甲苯胺藍(lán)染色。首先，將培養(yǎng)好的軟骨細(xì)胞用蒸餾水沖洗3～5遍，并將軟骨細(xì)胞浸泡在1.5 ml的甲苯胺藍(lán)染液內(nèi)，浸泡3 min，再用蒸餾水清洗3次，最后使用無水乙醇對其進(jìn)行脫水作用，光鏡下觀察并拍照。(3)免疫組織化學(xué)染色：將體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞接種在蓋玻片上，連續(xù)培養(yǎng)7 d后取出，首先，使用PBS將蓋玻片清洗輕輕沖洗3次后，使用4%多聚甲醛處理30 min，按照鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)法說明進(jìn)行Ⅱ型膠原酶的染色，對照組使用PBS替代一抗。

現(xiàn)場還有一塊示范田，將南京農(nóng)業(yè)大學(xué)的多項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行了集成應(yīng)用，包括智能化育秧、秸稈綠色綜合利用、機(jī)插—施肥—除草一體化、大田精確定量綠色智慧管理等技術(shù)，基本實(shí)現(xiàn)了全程機(jī)械化、綠色化、智能化生產(chǎn)，一個“智慧農(nóng)場”的雛形已清晰可見。

1.5退變軟骨細(xì)胞模型的建立及含藥血清干預(yù) 當(dāng)培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞傳至第2代時，予軟骨細(xì)胞10 ng/ml的白細(xì)胞介素(IL)-1β 誘導(dǎo)獲得退變的軟骨細(xì)胞；持續(xù) 24 h 的誘導(dǎo)退變以后，棄去培養(yǎng)液，換成4 種不同的培養(yǎng)體系分別進(jìn)行培養(yǎng)。

1.6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測各組上清中IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α的表達(dá)情況 細(xì)胞培養(yǎng)的上清液使用ELISA試劑盒檢測IL-1β的水平，嚴(yán)格根據(jù)說明書上面的操作步驟進(jìn)行，即分步驟進(jìn)行包板、洗板、加樣品、密封室溫?fù)u床孵育等過程。

1.7Western印跡法檢測含藥血清干預(yù)后退變軟骨細(xì)胞中磷酸化(p)-ERK1/ERK2、p-p38MAPKs 及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-3蛋白表達(dá)

1.7.12 h含藥血清干預(yù)結(jié)束后，退變軟骨細(xì)胞中總蛋白的提取 ①首先，用RIPA裂解液中和苯甲基磺酰氟(PMSF)(100 mmol/L)，按100∶1的比例混勻，置于冰上備用。②棄去經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)退變的軟骨細(xì)胞得培養(yǎng)液，加入預(yù)冷的PBS，漂洗2次，去除PBS，向每一個培養(yǎng)瓶中加入RIPA裂解液，混和均勻，放置在冰上30 min。③待軟骨細(xì)胞充分裂解后，使用細(xì)胞利刀將細(xì)胞刮下來，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的 EP管中，12 000 r/min，4℃離心10 min。④將上清液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的新 EP管中，預(yù)留10 μl用于蛋白濃度測定。⑤每根 EP管中蛋白上清與蛋白定量緩沖液按4∶1的比例混勻，置于100℃加溫機(jī)中加熱5 min使蛋白質(zhì)變性、分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.2Western印跡法檢測蛋白表達(dá) (1)配膠：按照表1的反應(yīng)物和12%分離膠及5%濃縮膠的液體量進(jìn)行配膠。(2)灌膠：預(yù)先將玻板洗滌干凈，并安裝好備用，確認(rèn)沒有漏水，進(jìn)行灌膠，首先將12%的分離膠灌入玻璃板，然后使用正丁醇將分離膠的上層壓成一平面。等到分離膠凝固了，把正丁醇倒掉，用蒸餾水沖洗干凈，同時再用濾紙把膠面頂層殘留的蒸餾水洗凈，最后把濃縮膠灌入，與此同時，迅速地插入梳子，使其在室溫下凝固。

表1 分離膠和濃縮膠的配制

(3) 加樣：往每一個孔內(nèi)加樣的量相同，都是40 μg的蛋白，每孔上樣量蛋白濃度為40 μg，依次把待測樣品上樣，在膠左側(cè)加入5 μl的蛋白 Marker。(4)電泳：讓濃縮膠在80 V的電壓下進(jìn)行電泳，當(dāng)染料跑至分離膠的時候，可以將電壓改為100 V，也可以不改，電泳繼續(xù)進(jìn)行。(5)檢測蛋白：①電泳過后，取下一塊膠，轉(zhuǎn)移到一個盛有考馬斯亮藍(lán)(CBB)的容器內(nèi)，注意切勿將其弄碎或破損；②搖床染色，時間為20 min，染色完畢，收回染色液；③運(yùn)用脫色液進(jìn)行脫色，脫至蛋白條帶清晰可見，然后用雙蒸餾水沖洗，3～5次為宜，最后CBB染色。(6) 轉(zhuǎn)膜：①預(yù)處理：先將聚偏二氟乙烯(PVDF)膜浸泡在無水甲醇中，保持10 min，提前剪好轉(zhuǎn)膜所需的海綿和濾紙，并將其與浸泡過的PVDF膜一同放入內(nèi)裝轉(zhuǎn)膜緩沖液的托盤中，再次浸泡15 min；②轉(zhuǎn)膜：按照順序依次放好，將電轉(zhuǎn)夾夾好，并將電轉(zhuǎn)夾插進(jìn)裝滿轉(zhuǎn)膜緩沖液的電泳槽內(nèi)，電泳槽置于盛有冰塊的泡沫塑料盒內(nèi)，在100 V電壓下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜55 min；③封閉：當(dāng)轉(zhuǎn)膜完畢后，取出PVDF膜，浸泡于封閉液中，閉封于室溫下2 h；④一抗孵育：將PVDF膜放入一抗稀釋液(CyclinD1，1∶400；CDK4，1∶400；pRb，1∶500；p16，1∶600)，4℃搖床孵育過夜；⑤二抗孵育：次日一早將PVDF膜取出，沖洗10 min×3次。最后再把膜放入二抗稀釋液中，孵育1 h，沖洗10 min×3次。 (7)成像與結(jié)果分析：參照電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒的說明書，按 A液：B液為1∶1，置于1.5 ml的 EP管內(nèi)充分混合均勻，將其滴在膜的蛋白面，室溫下放置1 min。凝膠成像儀下顯影、拍照。并用分析凝膠圖像的相應(yīng)軟件分析不同種蛋白的表達(dá)量及與內(nèi)參的比值。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS13.0進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

圖1 倒置顯微鏡下接種后不同階段大鼠軟骨細(xì)胞的形態(tài)變化(×100)

72 h 時，軟骨細(xì)胞大部分貼壁，分裂增殖速度增快。培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞胞質(zhì)較豐富，可見清晰的胞核，有 1～2個核仁(圖1B)；約 4 d左右匯合成單層鋪滿整個培養(yǎng)皿底面(圖1C)；傳代后生長速度加快，約4 d左右便開始傳代，細(xì)胞周圍可見具有折光性的ECM，細(xì)胞長成一片，呈“鋪路石”狀外觀( 圖 1D) ；當(dāng)傳代傳至第5代時，細(xì)胞的形態(tài)逐漸有所變化，部分變?yōu)殚L梭形，同時也會出現(xiàn)形態(tài)不規(guī)則的細(xì)胞(圖1E)；當(dāng)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)至第 7 代以后，絕大部分細(xì)胞呈梭形，生長速度減慢，傳代周期亦延長(圖1F)。

2.2軟骨細(xì)胞的鑒定結(jié)果 甲苯胺藍(lán)染色后可見細(xì)胞核呈深藍(lán)色，有 1～2 個核仁，胞質(zhì)呈淡藍(lán)色，細(xì)胞外基質(zhì)著淺藍(lán)色，見圖2。軟骨細(xì)胞的胞質(zhì)經(jīng)異硫氰酸熒光素(FITC)染色后發(fā)出鮮亮的綠色熒光，呈強(qiáng)陽性，細(xì)胞核區(qū)域沒有著色。細(xì)胞核經(jīng)4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色后激發(fā)出藍(lán)色熒光。從圖3可以看出，幾乎全部細(xì)胞表達(dá)了 Ⅱ型膠原，進(jìn)一步證明本實(shí)驗(yàn)得到了純度很高的軟骨細(xì)胞。

圖2 甲苯胺藍(lán)染色(×100)

圖3 Ⅱ型膠原免疫熒光染色(×100)

2.3軟骨細(xì)胞的生長曲線 1～3代軟骨細(xì)胞生長速度相差不大，當(dāng)傳至第4代以后，細(xì)胞增殖速度變慢。 MTT比色法顯示，第2代軟骨細(xì)胞的生長曲線近似“ S ”形。第1～3天處于生長潛伏期，第4～8天軟骨細(xì)胞呈對數(shù)生長，約在第9～10天達(dá)到平臺期，至第11天開始出現(xiàn)生長抑制，見圖4。

圖4 第2代軟骨細(xì)胞的生長曲線

2.4補(bǔ)腎益肝方對IL-1β、TNF-α表達(dá)的影響 低、中、高劑量組IL-1β、TNF-α表達(dá)水平均顯著低于對照組(P<0.05,P<0.01)。見表2。

表2 補(bǔ)腎益肝活血方對軟骨細(xì)胞IL-1β、TNF-α表達(dá)的影響

與對照組比較:1)P<0.05，2)P<0.01；表3同

2.5補(bǔ)腎益肝方對軟骨細(xì)胞ERK、p38MAPK表達(dá)的影響 低、中、高劑量組ERK、p38MAPK與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。見表3。

表3 補(bǔ)腎益肝活血方對軟骨細(xì)胞ERK、p38MAPK表達(dá)的影響

3 討 論

OA是一種退行性變的疾病，好發(fā)于老年人，據(jù)統(tǒng)計，我國40歲以上人群原發(fā)性O(shè)A患病率為46.3%〔2〕。OA的特征性改變是軟骨的退變和關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)的增生，實(shí)驗(yàn)室表現(xiàn)為進(jìn)行性的關(guān)節(jié)軟骨破壞和骨贅的形成，軟骨變性是OA的最基本病理改變〔3，4〕。OA可同時伴有不同程度的滑膜炎癥，最終可以出現(xiàn)關(guān)節(jié)的疼痛、僵硬、肥大及功能活動等受到限制〔5，6〕。關(guān)節(jié)軟骨的退變與破壞是OA 最主要的病理環(huán)節(jié)，軟骨組織內(nèi)只有一種細(xì)胞成分，就是軟骨細(xì)胞，而軟骨細(xì)胞在體內(nèi)不增殖〔7，8〕。為了本研究的進(jìn)一步進(jìn)行，本研究采用體外實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)方法，用SD雌性大鼠肋骨的軟骨細(xì)胞進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)。

軟骨細(xì)胞在維持關(guān)節(jié)軟骨的正常結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)揮重要的作用，當(dāng)軟骨細(xì)胞受到外力或TNF、表皮細(xì)胞生長因子(EGF)及IL-1等促炎細(xì)胞因子刺激后，便會通過細(xì)胞內(nèi)的ERK1/2、p38MAPK等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，把信號傳遞給各種細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，并通過對酪氨酸和蘇氨酸雙位點(diǎn)磷酸化、酶與酶之間互相作用或通過MAPK在受體結(jié)合部位相互影響的能力激活MAPKs通路〔9，10〕，從而影響MMPs的表達(dá)，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞肥大和ECM代謝失調(diào)〔11，12〕。有研究提出〔13〕IL-1參與了OA ECM丟失的全過程，并通過實(shí)驗(yàn)證明，向?qū)嶒?yàn)動物模型的關(guān)節(jié)內(nèi)注射IL-1并檢測蛋白多糖，IL-1可以誘導(dǎo)蛋白多糖的丟失，表明IL-1受體阻滯劑可使動物模型OA軟骨的破壞得到延緩，證實(shí)了IL-1在OA發(fā)生發(fā)展過程中的功能?？寺〔⒓兓驣L-1可以誘導(dǎo)MMP的表達(dá)、能夠促使分解代謝等因子還有其他炎癥因子等的表達(dá)，這也是IL-1作用于軟骨細(xì)胞致使OA發(fā)生發(fā)展的機(jī)制所在〔14〕。前列腺素(PG)E2具有刺激Ⅱ型膠原基因表達(dá)而抑制Ⅰ型膠原基因表達(dá)的作用，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)IL-1刺激軟骨細(xì)胞導(dǎo)致Ⅱ型膠原基因表達(dá)被抑制、Ⅰ型膠原的生成被上調(diào)，PGE2的生成則會增加，這正是機(jī)體的負(fù)反饋機(jī)制的體現(xiàn)〔15〕。研究表明，IL-1能夠協(xié)同抑瘤素(OS)M刺激軟骨細(xì)胞產(chǎn)生蛋白多糖酶和MMPs〔16〕。因此，本研究運(yùn)用IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞，建立退變的軟骨細(xì)胞模型。

關(guān)于p38MAPK及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究，研究證實(shí)，p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是軟骨細(xì)胞退化及關(guān)節(jié)軟骨破壞過程當(dāng)中主要的信號傳導(dǎo)途徑之一〔17〕。第一，軟骨細(xì)胞退變中 IL-1β 激活了p38MAPK信號通路〔18〕；第二，p38MAPK信號通路參與了MMPs 過度表達(dá)，進(jìn)而加劇了軟骨細(xì)胞的退變，如Roth等〔19〕研究結(jié)果表明 OA 患者關(guān)節(jié)液中MMP-3 過表達(dá)，應(yīng)用 p38MAPK 信號通路阻滯劑后可以顯著降低 MMP-3 的表達(dá);第三，該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡〔20〕。

近年來，關(guān)于單味中藥及中藥經(jīng)方、中藥復(fù)方治療OA的實(shí)驗(yàn)研究逐漸成為研究熱點(diǎn)，同時中藥治療OA的療效較為確切。研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥治療OA的機(jī)制較為復(fù)雜，涉及細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的各個環(huán)節(jié)，包括抑制細(xì)胞因子的釋放、抑制軟骨細(xì)胞的凋亡、促軟骨細(xì)胞的增殖、抑制NO合成、下調(diào)MMPs水平，使關(guān)節(jié)軟骨的代謝恢復(fù)平衡〔21〕。補(bǔ)腎益肝活血方治療肋骨關(guān)節(jié)炎，取得良好臨床效果。前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎益肝活血方能夠誘導(dǎo)BMSCs成軟骨細(xì)胞分化，參與軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，推測其作用機(jī)制很可能與MMP-3和纖維蛋白樣細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(EFEMP)-1這兩個激酶存在一定的聯(lián)系。

中醫(yī)認(rèn)為，OA屬中醫(yī)“痹證”、“傷筋”范疇，由于汗出當(dāng)風(fēng)，或涉水冒寒，或居處潮濕，致使風(fēng)、寒、濕等邪氣痹組經(jīng)脈，阻滯經(jīng)絡(luò)、氣血的運(yùn)行，屬本虛標(biāo)實(shí)證，以肝腎不足，精血虧損為本，而外來的風(fēng)、寒、濕邪氣及痰、瘀等病理產(chǎn)物為標(biāo)。

痹證在臨床治療中，常見的有如下三個證型：①風(fēng)寒濕痹；②風(fēng)濕熱痹；③痰瘀痹阻及久痹正虛。當(dāng)痹證病程日久者，可出現(xiàn)痰瘀痹阻氣血不足及肝腎虧虛。補(bǔ)腎益肝活血方中骨碎補(bǔ)入肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)肝強(qiáng)腎，有治本之功，是為君藥，；丹參，活血化瘀，消腫除脹，是為臣藥；沒藥，活血散瘀、消腫止痛，是為佐藥；懷牛膝，活血化瘀，同時補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨，引藥下行，是為佐藥，全方共奏補(bǔ)腎益肝、活血化瘀、消腫止痛之功。

補(bǔ)腎益肝活血方主要針對OA肝腎虧虛、風(fēng)寒濕痹阻的共性病機(jī)，具有補(bǔ)益肝腎，蠲痹止痛之功效，臨床療效確切。前期研究發(fā)現(xiàn)該方有抑制軟骨細(xì)胞凋亡的作用，其含藥血清能有效誘導(dǎo)BMSCs分化成軟骨細(xì)胞，其作用機(jī)制與MMP-3的表達(dá)存在相關(guān)性。研究表明，MMP-3的表達(dá)是由ERK1/2 和P38MAPK信號通路介導(dǎo)〔22～24〕。

綜上，本研究結(jié)果表明補(bǔ)腎益肝活血方可通過調(diào)節(jié)ERK、p38 MAPK的表達(dá)，使退化的軟骨細(xì)胞恢復(fù)正常。