ε-聚-L-賴氨酸及其抑菌機(jī)理研究進(jìn)展

李曉玥，劉 潭，楊 博

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙410128）

隨著人們對(duì)食品安全性的認(rèn)識(shí)和要求日益提高，開(kāi)發(fā)抗菌性強(qiáng)、水溶性好、安全無(wú)毒的天然食品防腐劑已成為全世界食品領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。ε-聚-L-賴氨酸（ε-Poly-L-lysine，ε-PL）是一種天然生物防腐劑，具有抑菌譜廣、水溶性好、安全性高、熱穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，其優(yōu)良的防腐性能符合人們對(duì)于新型食品防腐劑的要求［1］。ε-PL在日本、韓國(guó)等國(guó)家已作為食品防腐劑廣泛使用［2］。2004年，其被美國(guó)食品和藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)為安全食品保鮮劑（GRAS）［3］。我國(guó)也在2014年正式批準(zhǔn)其作為食品添加劑新品種［4］。近年來(lái)，ε-PL在食品等領(lǐng)域的應(yīng)用與發(fā)展，激發(fā)了研究者對(duì)其抑菌作用機(jī)理的探尋。本文在介紹ε-PL特性、菌種選育、發(fā)酵生產(chǎn)和應(yīng)用的基礎(chǔ)上，對(duì)其抑菌作用機(jī)理進(jìn)行了綜述。

1 ε-PL的特性

ε-PL通常由25～35個(gè)L-賴氨酸通過(guò)ε-氨基和α-羧基脫水縮合形成酰胺鍵聚合而成，是一種同型單體多肽聚合物。ε-PL的結(jié)構(gòu)如圖1。ε-PL的水溶性和熱穩(wěn)定性良好，其水溶液在120℃高壓滅菌處理20 min不會(huì)發(fā)生分解作用［5］。ε-PL分子量一般為2.5～4.5 kDa，為白色或淡黃色粉末，吸濕性較強(qiáng)，略帶苦味，微溶于乙醇，不溶于乙酸乙酯、乙醚等有機(jī)溶劑［6～8］。由于ε-PL是混合物，所以沒(méi)有固定的熔點(diǎn)，250℃開(kāi)始軟化分解［9］。紅外光譜分析表明，ε-PL在1680～1640 cm-1和1580～1520 cm-1有強(qiáng)吸收峰［10］。

圖1 ε-PL的結(jié)構(gòu)

2 ε-PL產(chǎn)生菌的選育

ε-PL的等電點(diǎn)約為9.0，當(dāng)環(huán)境溶液pH＜9.0時(shí)，其呈酸性帶正電荷，這為ε-PL菌株的篩選提供了便利［11］。在篩菌時(shí)，菌株分泌的帶正電荷的ε-PL可與帶相同電荷的瓊脂或堿性染料分子（如亞甲基藍(lán)等）產(chǎn)生靜電斥力，從而在菌株周圍形成肉眼可見(jiàn)的透明圈。同時(shí)，屬于生物堿的ε-PL還可與Dragendorff或Wagner試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，因此可簡(jiǎn)便快速地從環(huán)境中篩選出ε-PL產(chǎn)生菌［12］。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的工作以獲取菌種種質(zhì)資源，分離得到10余種ε-PL產(chǎn)生菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)、理化性質(zhì)、16SrDNA測(cè)序并進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析等鑒定工作，確定這些來(lái)源菌株屬于鏈霉菌屬、北里孢菌屬、麥角菌屬等幾類微生物［13］。現(xiàn)今ε-PL的發(fā)酵生產(chǎn)通常采用鏈霉菌屬中的白色鏈霉菌（Streptomyces albulus）。

由于從自然界中篩選的ε-PL產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)速率和ε-PL產(chǎn)量較低，難以滿足生產(chǎn)的需求，故研究者們對(duì)ε-PL產(chǎn)生菌進(jìn)行了大量的育種工作，以提高野生菌的ε-PL產(chǎn)量。鑒于ε-PL產(chǎn)生菌的遺傳背景較復(fù)雜且尚未揭示清楚，目前關(guān)于ε-PL產(chǎn)生菌的育種工作多采用誘變育種的方式進(jìn)行。Hiraki等［14］利用亞硝基胍（NTG）誘變，并在培養(yǎng)基中加入S-（2-氨基乙基）-L-半胱氨酸（AEC）和甘氨酸進(jìn)行脅迫，在經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá)20次的誘變后，獲得了一株ε-PL產(chǎn)量達(dá)2.11 g/L的突變株。陳瑋瑋等［15］使用硫酸二乙酯（DES）對(duì)北里孢菌PL6-3進(jìn)行化學(xué)誘變，并在培養(yǎng)基中加入AEC，獲得了一株突變株MY5-36，經(jīng)搖瓶發(fā)酵后其ε-PL產(chǎn)量達(dá)到1.17 g/L，是出發(fā)菌株的3倍，且經(jīng)5 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵后的ε-PL產(chǎn)量高達(dá)7.72 g/L，較出發(fā)菌株提高了7倍以上。李南臻等［16］利用60Co和常壓室溫等離子體（ARTP）誘變法對(duì)白色鏈霉菌H菌株進(jìn)行復(fù)合誘變，最終選育出一株高產(chǎn)突變株H1-2，經(jīng)10 L發(fā)酵罐發(fā)酵后的ε-PL產(chǎn)量高達(dá)24.50 g/L，較出發(fā)菌株提高了88.5%。此外，核糖體工程、基因工程等新興技術(shù)的發(fā)展，加快了育種周期。吳光耀等［17］利用核糖體工程育種方法，成功地將ε-PL的產(chǎn)量提高至3.70 g/L。Li等［18］發(fā)現(xiàn)，通過(guò)基因組重排技術(shù)可以提高菌體對(duì)葡萄糖的利用率，最終使ε-PL的產(chǎn)量提高了1.88倍。

3 ε-PL的發(fā)酵生產(chǎn)

目前，日本等國(guó)家通過(guò)微生物發(fā)酵法已經(jīng)實(shí)現(xiàn)ε-PL的工業(yè)化生產(chǎn)，而我國(guó)對(duì)ε-PL的研究基本還處于實(shí)驗(yàn)階段，僅有浙江新銀象等少數(shù)幾家公司進(jìn)行了商業(yè)化應(yīng)用。關(guān)于ε-PL的發(fā)酵生產(chǎn)，可通過(guò)優(yōu)化菌種培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的方式提高ε-PL的產(chǎn)量。Shima等［19］利用野生菌S.albulus，探究了不同碳氮源對(duì)其代謝產(chǎn)ε-PL的影響，發(fā)現(xiàn)葡萄糖或甘油可以作為碳源被利用，而氮源可以是硫酸銨或者是酵母膏。Shih等［20］使用響應(yīng)面法對(duì)S.albulus菌種的培養(yǎng)基成分進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明對(duì)該菌株產(chǎn)ε-PL影響最大的3個(gè)因素分別為酵母膏、硫酸銨以及葡萄糖，經(jīng)優(yōu)化后，ε-PL產(chǎn)量從0.75 g/L增長(zhǎng)到了8.13 g/L，產(chǎn)量提高了將近10.84倍。另外，培養(yǎng)過(guò)程中的pH對(duì)ε-PL產(chǎn)量也有一定影響。當(dāng)菌體的生物量積累到一定程度時(shí)，培養(yǎng)基的pH值降低到4.2左右對(duì)于ε-PL的積累是至關(guān)重要的。Kahar等［21］利用S.albulus410菌株建立了pH兩階段調(diào)控的發(fā)酵工藝，先將pH值控制在5.0以上以積累菌體量，再將pH值控制在有利于菌體代謝產(chǎn)生ε-PL的4.0環(huán)境，這使得ε-PL產(chǎn)量大大提高，從原始的5.72 g/L提高到了48.35 g/L。

4 ε-PL的應(yīng)用

ε-PL作為一種性能優(yōu)良的天然防腐劑，目前主要作為食品添加劑廣泛應(yīng)用于米飯、面食、魚(yú)類制品等傳統(tǒng)食品的防腐保鮮［22］。在日本，利用ε-PL作為食品防腐劑的商業(yè)化應(yīng)用發(fā)展迅速，市場(chǎng)規(guī)模早已超過(guò)數(shù)十億日元。ε-PL作為新型食品防腐劑，不僅可以單獨(dú)使用，還可與其他食品添加劑混合使用以提高防腐能力。徐紅華等［23］研究發(fā)現(xiàn)，ε-PL和甘氨酸復(fù)配能夠延長(zhǎng)牛奶的貨架期，保存11 d后仍無(wú)變質(zhì)跡象。ε-PL還可作為藥物及DNA的載體，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和制藥領(lǐng)域。氨甲蝶呤是目前治療白血病和惡性腫瘤最為常用的藥物，它與作為載體的ε-PL相結(jié)合，能使靶細(xì)胞對(duì)它吸收率大大提高［24］。另外，ε-PL為多陽(yáng)離子聚合物，還能與帶電質(zhì)粒經(jīng)靜電相互作用形成一種內(nèi)含可避免核酸酶降解的基因復(fù)合物，從而提升基因DNA藥物的轉(zhuǎn)移效率［25］。除此之外，ε-PL還可作為吸水材料，與丙烯乙二醇酯結(jié)合形成具有高吸水性的水凝膠，該水凝膠對(duì)吸水量的反應(yīng)靈敏度較高，且具有一定的抑菌活性，可廣泛應(yīng)用于衛(wèi)生巾及嬰兒紙尿褲等系列產(chǎn)品中［26］。

ε-PL廣泛應(yīng)用的同時(shí)，其安全性也受到考量。Neda等［27］通過(guò)小鼠慢性和亞急性灌胃實(shí)驗(yàn)及對(duì)ε-PL的毒理學(xué)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)ε-PL在各種實(shí)驗(yàn)條件下均無(wú)任何毒性，且對(duì)神經(jīng)、免疫、生殖系統(tǒng)以及胚胎發(fā)育都不會(huì)產(chǎn)生毒害。Hiraki等［28］通過(guò)放射法研究發(fā)現(xiàn)，ε-PL在胃腸道內(nèi)幾乎不被吸收，7日內(nèi)檢測(cè)到放射性標(biāo)記的ε-PL經(jīng)排泄途徑緩慢排出，在機(jī)體內(nèi)不存在累積作用。因此ε-PL作為一種新型的生物防腐劑是安全可靠的。

5 ε-PL的抑菌機(jī)理

5.1 ε-PL的抑菌作用

ε-PL具有廣譜抗菌性，且經(jīng)加熱后也能發(fā)揮較好的抑菌效果，并在與其他防腐劑或試劑（如乳酸鏈球菌素、醋酸等）復(fù)合使用時(shí)可在一定程度上提高抑菌活性。Shima［29］于1984年首次提出了ε-PL的抑菌性，發(fā)現(xiàn)ε-PL對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)繁殖均有著顯著的抑制作用。研究表明，ε-PL對(duì)能夠引起食物腐敗的多數(shù)菌種均有一定的抑制作用，如酵母菌屬中的尖銳假絲酵母、紅發(fā)夫酵母，革蘭氏陽(yáng)性菌中的凝結(jié)芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌，革蘭氏陰性菌中的產(chǎn)氣節(jié)桿菌、大腸桿菌等，故ε-PL的抑菌范圍較廣［30］。ε-PL經(jīng)80、100、121℃處理一定時(shí)間后，其抑菌效果仍基本不變，具有較好的熱穩(wěn)定性［31］。另外，ε-PL還可與其他添加劑復(fù)合使用以增強(qiáng)抑菌效果。據(jù)報(bào)道，ε-PL與0.1%強(qiáng)醋酸的復(fù)合使用后的抑菌效果較單獨(dú)使用時(shí)明顯增強(qiáng)，其與0.1%甘氨酸的復(fù)合抑菌效果次之［31］。

5.2 ε-PL的抑菌機(jī)理

目前關(guān)于ε-PL抑菌作用機(jī)制的研究主要集中在釀酒酵母、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及李斯特菌等菌種，這些菌種分別代表真菌、革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌。根據(jù)菌種特性的不同，ε-PL的抑菌作用效果及機(jī)制有著較明顯的差異。

5.2.1 ε-PL對(duì)釀酒酵母的作用機(jī)制

ε-PL對(duì)真菌的抑菌機(jī)理研究，主要以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作為對(duì)象進(jìn)行探究。薄濤等［32］研究發(fā)現(xiàn)，ε-PL對(duì)釀酒酵母的抑菌作用強(qiáng)弱依賴于ε-PL所添加的濃度。添加低于200μg/mL的ε-PL對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)有一定的抑制作用，添加200～500μg/mL的ε-PL對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)有明顯抑制作用，而添加500μg/mL以上的ε-PL則對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)致死率高達(dá)100%。這種與作用濃度相關(guān)的現(xiàn)象，可能是ε-PL存在一定的作用閾值濃度。此外，研究發(fā)現(xiàn)ε-PL可提高酵母細(xì)胞膜的通透性和疏水性。同時(shí)，二價(jià)陽(yáng)離子可對(duì)ε-PL的抑菌活性產(chǎn)生一定影響。當(dāng)二價(jià)陽(yáng)離子（如Mg2+、Ca2+等）濃度達(dá)到一定值時(shí)，可對(duì)ε-PL抑菌活性產(chǎn)生削弱作用。利用掃描電子顯微鏡（SEM）對(duì)不同濃度ε-PL處理后的細(xì)胞表面進(jìn)行觀察后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用500μg/mL的ε-PL處理釀酒酵母后，其細(xì)胞表面會(huì)出現(xiàn)孔洞、微膠粒或發(fā)生磷脂雙分子層的彎曲等現(xiàn)象。

另外，ε-PL對(duì)釀酒酵母的抑制作用還可能與細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平上調(diào)引起的細(xì)胞凋亡相關(guān)。Tan等［33］使用二氫睪酮羅丹明123（DHR 123）測(cè)定了經(jīng)ε-PL處理后的釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，并利用4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚（DAPI）對(duì)細(xì)胞核DNA分子進(jìn)行染色，以考察核DNA的變化。結(jié)果表明，ε-PL處理細(xì)胞12 h后，細(xì)胞內(nèi)的ROS水平顯著上調(diào)，同時(shí)觀察到DNA的片段化，細(xì)胞發(fā)生死亡。推測(cè)該現(xiàn)象與細(xì)胞凋亡現(xiàn)象類似，但仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證。Liu等［34］對(duì)ε-PL和乳酸鏈球菌素（Nisin）組合使用后的抑菌效果及協(xié)同抗菌機(jī)制進(jìn)行了探究，發(fā)現(xiàn)Nisin能迅速破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，有利于ε-PL隨即進(jìn)入細(xì)胞，與核DNA相互作用以阻止DNA復(fù)制。這項(xiàng)研究為ε-PL抑菌機(jī)制中有關(guān)ε-PL引起ROS水平上調(diào)、作用于核DNA進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的闡明奠定了基礎(chǔ)。Ye等［45］研究也發(fā)現(xiàn)，ε-PL作為一種多肽類抑菌劑，會(huì)在大腸桿菌中引起ROS脅迫，并且DNA損傷應(yīng)答（SOS應(yīng)答）調(diào)節(jié)基因的表達(dá)會(huì)受到ε-PL的影響。

近年來(lái)，代謝組學(xué)技術(shù)的蓬勃發(fā)展也推動(dòng)了ε-PL抑菌機(jī)制的闡明。代謝組學(xué)旨在系統(tǒng)地分析生物中整個(gè)小分子代謝物的組成和動(dòng)態(tài)響應(yīng)，進(jìn)而揭示生命的表型變化。Bo等［35］通過(guò)GC-MS等技術(shù)分析檢測(cè)了經(jīng)ε-PL處理后的釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)代謝物的變化情況。結(jié)果表明，ε-PL處理釀酒酵母后，能引起細(xì)胞內(nèi)多種代謝物（主要包括碳水化合物、醇類、脂類和氨基酸）的代謝水平發(fā)生變化。ε-PL會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的積累，這表明其可能抑制了糖酵解過(guò)程。同時(shí)，它會(huì)引起糖酵解途徑的中間代謝物（如3-P-甘油酸、丙酮酸等）的濃度降低，這意味著ε-PL可能會(huì)對(duì)糖酵解途徑產(chǎn)生抑制。另外，它還能使三羧酸循環(huán)中間體（如谷氨酸、尿素、鳥(niǎo)氨酸等）濃度增加，從而使琥珀酸鹽濃度降低，這表明α-酮戊二酸主要轉(zhuǎn)化為谷氨酸，進(jìn)而可能導(dǎo)致ε-PL對(duì)三羧酸循環(huán)的抑制。以上研究表明，ε-PL可能通過(guò)破壞膜功能，間接地抑制中心碳代謝，從而使菌種對(duì)數(shù)期延長(zhǎng)，抑制菌種的生長(zhǎng)，或作用于與代謝密切相關(guān)的細(xì)胞膜，使磷脂層瓦解，從而使菌種死亡。

5.2.2 ε-PL對(duì)大腸桿菌的作用機(jī)制

ε-PL對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌的抑菌機(jī)理研究，主要以大腸桿菌（Escherichia coli）作為對(duì)象進(jìn)行探究。ε-PL對(duì)大腸桿菌的抑菌作用強(qiáng)弱同樣依賴于ε-PL所添加的濃度。付萍［36］的研究表明，50μg/mL以下的ε-PL處理大腸桿菌后可使其對(duì)數(shù)期延長(zhǎng)，50～150μg/mL的ε-PL處理大腸桿菌后可使其生長(zhǎng)受到明顯抑制，而150μg/mL以上的ε-PL處理大腸桿菌后可使其菌液近乎澄清。這同樣表明ε-PL發(fā)揮抑菌作用需要一定的閾值濃度。由于大腸桿菌作為一種革蘭氏陰性菌，具有內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)，所以，研究者考察了不同濃度的ε-PL對(duì)大腸桿菌內(nèi)外膜的作用［36～38］。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高濃度ε-PL對(duì)細(xì)胞外膜的破壞作用較強(qiáng)，作用40 min后，由疏水探針NPN（NPhenyl-1-naphthylamine）標(biāo)記的細(xì)胞外膜的熒光強(qiáng)度變化趨于平緩。推測(cè)帶正電荷的ε-PL可能與大腸桿菌表面呈負(fù)電荷的脂多糖通過(guò)靜電作用結(jié)合，從而使大腸桿菌外膜通透性增加。同時(shí)，ε-PL處理菌體后經(jīng)不同時(shí)間段檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)膜的β-半乳糖苷酶含量均無(wú)明顯變化，而用不同濃度的ε-PL處理大腸桿菌后，其內(nèi)膜的β-半乳糖苷酶含量會(huì)發(fā)生明顯變化。這表明ε-PL對(duì)大腸桿菌的作用是瞬時(shí)的，并會(huì)造成菌體內(nèi)膜的通透性發(fā)生改變。利用掃描電子顯微鏡（SEM）對(duì)ε-PL處理后的大腸桿菌表面的形態(tài)變化進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)經(jīng)不同濃度的ε-PL處理后，菌體細(xì)胞表面會(huì)呈現(xiàn)出明顯的褶皺、凸起和凹陷，同時(shí)菌體間會(huì)發(fā)生聚集粘連。這一現(xiàn)象與抗菌肽抑菌機(jī)理中的氈毯模型極為相似。

Hyldgaard等也對(duì)ε-PL作用于大腸桿菌的抑菌機(jī)制進(jìn)行了研究［38］。他們測(cè)定了大腸桿菌細(xì)胞膜表面的Zeta電位，并同樣研究了二價(jià)陽(yáng)離子對(duì)抗菌活性的影響，同時(shí)通過(guò)原子力顯微鏡（AFM）觀測(cè)了ε-PL對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響。發(fā)現(xiàn)在對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行熒光標(biāo)記后，有熒光小囊泡的形成，這進(jìn)一步驗(yàn)證了ε-PL的抑菌機(jī)理可能與抗菌肽抑菌機(jī)理中的氈毯模型類似。同時(shí)，Shima［39］和Vaara［40］發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)離子多肽ε-PL通過(guò)離子吸附與帶負(fù)電的細(xì)胞表面相互作用，可干擾并破壞LPS層，導(dǎo)致外膜透化。Hyldgaard等［38］進(jìn)一步考察了ε-PL對(duì)更高耐受性的大腸桿菌ΔrscC突變體的影響，發(fā)現(xiàn)莢膜外多糖莢膜異多糖酸的過(guò)量表達(dá)，有助于調(diào)節(jié)菌體生物膜的三維結(jié)構(gòu)，并起到一定的屏障作用。去除脂多糖后，發(fā)現(xiàn)ε-PL作用于膜磷脂。

5.2.3 ε-PL對(duì)枯草芽孢桿菌及李斯特菌的作用機(jī)制

ε-PL對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的抑菌機(jī)理研究，主要以枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）及李斯特菌（Listeria monocytogenes）作為對(duì)象進(jìn)行探究。Liu等［34］考察了ε-PL和Nisin對(duì)枯草芽孢桿菌細(xì)胞壁的影響，發(fā)現(xiàn)ε-PL單獨(dú)作用時(shí)僅使細(xì)胞輕微受損，Nisin單獨(dú)處理枯草芽孢桿菌后，細(xì)胞表面粗糙，細(xì)胞壁明顯受損。而當(dāng)兩種物質(zhì)復(fù)合作用時(shí)，可使細(xì)胞表層結(jié)構(gòu)明顯受損。同時(shí)細(xì)菌近似空心狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)含物逸出。由于Nisin主要被認(rèn)為作用于細(xì)胞表面，故推測(cè)ε-PL可能作用于微生物內(nèi)部結(jié)構(gòu)［41］。

Hyldgaard等［38］初步探究了ε-PL對(duì)李斯特菌的抑菌機(jī)理。發(fā)現(xiàn)ε-PL對(duì)菌體形態(tài)的影響較小，推測(cè)可能是肽聚糖對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的維持作用所引起。李斯特菌的細(xì)胞膜含有賴氨酸衍生的磷脂酰甘油和賴氨酰心磷脂［42～44］。賴氨酸心磷脂是兩性離子［43］，沒(méi)有凈負(fù)電荷，而磷脂酰甘油能進(jìn)一步減少細(xì)胞膜的負(fù)電荷，從而減少細(xì)胞膜對(duì)陽(yáng)離子肽即ε-PL的親和力［42］。因此ε-PL對(duì)李斯特菌具有較高的MIC，進(jìn)而經(jīng)ε-PL處理后，菌體細(xì)胞膜的通透性較低。綜上所述，關(guān)于ε-PL對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的抑菌機(jī)理研究報(bào)道較少，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步揭示。

5.2.4 ε-PL對(duì)不同菌種的抑菌作用機(jī)制比較

從上述ε-PL對(duì)不同菌種的作用機(jī)制來(lái)看，ε-PL對(duì)菌種產(chǎn)生抑制作用需要一定的閾值濃度，并可能因細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)不同而存在差異。在真菌釀酒酵母的研究中，500μg/mL的ε-PL可使菌種致死。而在革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌的研究中，150μg/mL的ε-PL即能使菌體聚合沉降，菌液變澄清。有研究推測(cè)這可能是由于革蘭氏陰性菌外膜主要由脂多糖和磷脂構(gòu)成，其肽聚糖層相對(duì)較薄且稀疏，故其機(jī)械強(qiáng)度偏低。酵母菌其細(xì)胞壁最外層為甘露聚糖蛋白，內(nèi)層葡聚糖起主要細(xì)胞機(jī)械強(qiáng)度的作用，因其交聯(lián)程度低，故機(jī)械強(qiáng)度相對(duì)較低，但高于革蘭氏陰性菌。而革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁富含交聯(lián)的肽聚糖層，具有較高的機(jī)械強(qiáng)度。所以，在前述的革蘭氏陽(yáng)性菌經(jīng)ε-PL處理后，其細(xì)胞表面變化可能相對(duì)穩(wěn)定［36］。

另外，從前述研究中還發(fā)現(xiàn)，ε-PL可能影響菌體細(xì)胞膜的通透性和疏水性。在釀酒酵母的研究中，經(jīng)碘化丙啶染色和熒光強(qiáng)度檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)500μg/mL的ε-PL對(duì)菌體細(xì)胞膜產(chǎn)生了損傷，增加了細(xì)胞膜的通透性。而在大腸桿菌的研究中，ε-PL影響了細(xì)胞內(nèi)外膜的通透性。有研究推測(cè)，酵母菌作為一種真菌，其細(xì)胞壁最外層為甘露聚糖蛋白，帶有負(fù)電荷。同樣，革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁富含脂多糖，會(huì)使菌體細(xì)胞表面帶有大量的負(fù)電荷。因此，帶較多負(fù)電荷的酵母菌和革蘭氏陰性菌的細(xì)胞表面與帶正電荷的ε-PL作用面積會(huì)較大。而革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)主要由肽聚糖組成，細(xì)胞表面所帶的負(fù)電荷通常較為稀疏，因此ε-PL可能只會(huì)對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的細(xì)胞壁造成局部破壞［36］。

5.2.5 ε-PL可能的抑菌機(jī)制模型

（1）ε-PL抑菌機(jī)制與氈毯模型。Hyldgaard等［38］研究了ε-PL的抑菌機(jī)制，從多方面驗(yàn)證并提出了ε-PL可能作用于膜磷脂進(jìn)而產(chǎn)生抑制作用的機(jī)制，并認(rèn)為ε-PL與大腸桿菌相互作用的模型很可能為氈毯模型（圖2）。氈毯模型是抗菌肽抑菌機(jī)制中的主要模型之一。在氈毯模型中，抗菌肽通過(guò)靜電吸附作用，與細(xì)胞膜上富含陰離子的磷脂分子頭部相結(jié)合，類似地毯狀地覆蓋于細(xì)胞膜磷脂雙分子層的表面。當(dāng)抗菌肽的濃度達(dá)到閾值后，會(huì)在細(xì)胞膜上形成瞬時(shí)孔洞，使更多未結(jié)合的抗菌肽進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。此時(shí)，磷脂雙分子層會(huì)發(fā)生彎曲及損傷，隨之細(xì)胞膜逐漸裂解并與抗菌肽結(jié)合形成微膠粒。而在前述的ε-PL對(duì)釀酒酵母的抑菌機(jī)制研究中，500 μg/mL的ε-PL作用于釀酒酵母時(shí)對(duì)其是完全抑制的，顯微觀察發(fā)現(xiàn)釀酒酵母經(jīng)一定濃度的ε-PL處理后表面有明顯的凹陷，并會(huì)形成微膠粒（圖2）。這些現(xiàn)象均從一定程度上印證了ε-PL抑菌機(jī)制與氈毯模型的相似性。

圖2 氈毯模型

（2）ε-PL抑菌機(jī)制與ROS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡模型。據(jù)報(bào)道，ε-PL抑菌機(jī)制可能與ROS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)。Ye等［45］研究發(fā)現(xiàn)，ε-PL會(huì)在大腸桿菌中引起ROS脅迫，且DNA損傷應(yīng)答（SOS應(yīng)答）調(diào)節(jié)基因的表達(dá)會(huì)受到ε-PL的影響。近年來(lái)，有較多研究報(bào)道了抗菌肽通過(guò)ROS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的模型，如有關(guān)PAF26、coprisin、melittin等的研究［46～48］。在前述的Tan等［33］報(bào)道的關(guān)于ε-PL對(duì)釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)ROS積累和DNA片段化的研究中，也進(jìn)一步闡述了該機(jī)制的可能性（圖3）。當(dāng)ε-PL處理細(xì)胞12 h后，細(xì)胞內(nèi)的ROS水平顯著上調(diào)，同時(shí)觀察到DNA的片段化，從而引起細(xì)胞死亡。同時(shí)，在與其他抑菌劑組合使用后的抑菌研究中，還發(fā)現(xiàn)ε-PL可與核DNA相互作用的現(xiàn)象。因此，ε-PL可能也會(huì)通過(guò)調(diào)控ROS水平間接影響DNA，從而使細(xì)胞凋亡。

圖3 ROS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡模型

6 ε-PL研究展望

ε-PL作為一種抗菌譜廣、安全無(wú)毒的天然食品防腐劑，具有廣闊的商業(yè)化前景。但目前ε-PL的生物合成機(jī)理和抑菌機(jī)制尚未揭示清楚，阻礙了其商業(yè)化應(yīng)用。因此，研究ε-PL的微觀合成機(jī)理及抑菌機(jī)理具有重要的科學(xué)意義。今后在探究上述機(jī)制的基礎(chǔ)上，可從菌種種質(zhì)資源改良、多組學(xué)分析、代謝調(diào)控及發(fā)酵優(yōu)化等方面對(duì)ε-PL產(chǎn)生菌進(jìn)行研究，以有效提高ε-PL的產(chǎn)量，并加強(qiáng)ε-PL的應(yīng)用研究，最終實(shí)現(xiàn)ε-PL的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。