蘋果樹腐爛病菌拮抗細菌篩選及鑒定

楊樹，劉海霞，范萬澤，李興昱，薛應鈺

(甘肅農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，植物病害生物防治實驗室，甘肅 蘭州 730070)

蘋果樹腐爛病是由Cytosporaspp.引起的一種真菌性病害，在中國的蘋果生產(chǎn)地區(qū)十分常見，患病果樹的枝干會枯死，甚至導致整棵樹死亡，從而毀滅果園[1-2].自1916年遼寧省首次發(fā)現(xiàn)蘋果樹腐爛病以來，出現(xiàn)了多次大流行.2008 年，據(jù)國家蘋果產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系調(diào)查，中國蘋果樹腐爛病總發(fā)病率為52.7%，部分地區(qū)發(fā)病率高達 85% 以上，造成了嚴重的經(jīng)濟損失[3-4].隨著中國蘋果樹栽培制度及種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整，蘋果樹腐爛病已經(jīng)成為限制中國蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素[5].目前蘋果樹腐爛病的防治主要以化學藥劑為主，但長期大量使用化學藥劑會引起一系列問題，如環(huán)境污染、食品安全和病原菌抗性等，因此，尋求一條新的防治途徑迫在眉睫[6-7].

生物防治具有高效、安全、低毒等特點.目前國內(nèi)外已有關于利用生防菌對蘋果樹腐爛病進行防治的報道.高克祥等[8]研究表明，從楊樹樹干分離的哈茨木霉的菌絲以及從蘋果樹腐爛病病疤中分離的深綠木霉菌絲均可以穿過蘋果樹腐爛病病菌菌絲生長，從而抑制蘋果樹腐爛病生長；Xin等[9]研究表明螺旋毛殼(Chaetomiumspirale) 對蘋果樹腐爛病菌有較強的重寄生或拮抗作用；鄧振山等[10]報道銀杏莖葉中分離出的球殼孢屬(Sphaeropsissp.)、匐柄霉屬(Stemphyliumsp.)、刺盤孢屬(Colletotrichumsp.)等內(nèi)生真菌可引起蘋果樹腐爛病菌菌絲畸形以及菌絲斷裂；郜佐鵬等[11]報道從黃瓜根葉分離得到多種內(nèi)生放線菌，其發(fā)酵濾液均能有效抑制蘋果樹腐爛病菌孢子萌發(fā)及菌絲生長；展麗然等[12]鑒定為鏈霉菌屬(Streptomyces) 的金色類群 (Aureus)的 Z-6 菌株對腐爛病亦有防效，但是，關于使用拮抗細菌防治蘋果樹腐爛病的報道很少.因此，本試驗從蘋果樹根際土壤及發(fā)病枝條中分離出對蘋果樹腐爛病菌具有良好抑制效果的拮抗細菌，確定其分類地位，以期為蘋果樹腐爛病的生物防治提供優(yōu)良的菌種資源.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 蘋果樹腐爛病菌(Cytosporaspp.) 由甘肅農(nóng)業(yè)大學植物保護學院植物病理學實驗室提供.

1.1.2 供試培養(yǎng)基 用NA培養(yǎng)基(蛋白胨10.0 g，牛肉膏3.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂15.0 g，pH 7.2～7.4)分離純化拮抗細菌[13]，用PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂15.0～20.0 g，水1 000 mL，pH 7.2～7.4)培養(yǎng)蘋果樹腐爛病菌，完成對峙試驗[14].

1.1.3 供試土壤及蘋果枝條 2015 年 7～9 月，于蘭州、平?jīng)?、慶陽各市‘富士’蘋果園采集.

1.2 拮抗細菌的分離純化

將各地采集回來的土壤過篩后，分別稱量10 g加入90 mL無菌水，于28 ℃、180 r/min條件下振蕩2 h，靜置；刮取并稱量感染蘋果樹腐爛病的樹皮1 g研磨至勻漿，加入9 mL無菌水振蕩30 min，靜置.使用接種環(huán)來蘸取上清液劃線直至獲得單菌落，置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d后，挑取單菌落進行純化，觀察記錄單個菌落大小、顏色、表面平滑度和邊緣形狀等，編號，于4 ℃下保存?zhèn)溆肹15].

1.3 拮抗細菌的篩選

1.3.1 蘋果樹腐爛病拮抗細菌的初篩 采用平板對峙法[16].在PDA平板的背面用“十”字交叉法做標記，將蘋果樹腐爛病菌菌餅(d=5 mm)接于培養(yǎng)基中央，菌落面向下，在“十”字兩端等距離(離中心30 mm)接各拮抗細菌菌餅，每個處理重復3次，以僅接蘋果樹腐爛病菌的平板為對照，置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待對照菌絲鋪滿整個平板時，用“十”字交叉法測量菌落直徑，并根據(jù)公式計算抑菌率.

(1)

1.3.2 蘋果樹腐爛病拮抗細菌的復篩 將初篩得到的菌株接種在80 mL的NB液體培養(yǎng)基中，于180 r/min、28 ℃下振蕩培養(yǎng)48 h.取發(fā)酵液，于4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清液經(jīng)0.22 μm微孔過濾器過濾，收集發(fā)酵濾液(原液)，于4 ℃保存?zhèn)溆?

將制備好的發(fā)酵濾液加入PDA培養(yǎng)基混合均勻，制備5倍、10倍和20倍稀釋液，將蘋果樹腐爛病菌菌餅(d=5mm)接于培養(yǎng)基中央，菌落面向下，以加等量無菌水的PDA培養(yǎng)基為對照，每處理重復3次.置于25 ℃下暗培養(yǎng)，待對照菌絲鋪滿整個培養(yǎng)皿后，用“十”字交叉法測量菌落直徑，并根據(jù)公式(1)計算抑菌率.

1.4 拮抗細菌的鑒定

1.4.1 形態(tài)及培養(yǎng)特征觀察 參考鄧剛等[17]方法對篩選出的拮抗菌株的菌落培養(yǎng)特征與形態(tài)特征等進行鑒定.

1.4.2 生理生化特性測定 通過參考《常用細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[15]和《伯杰氏細菌鑒定手冊》[18]中的方法測定拮抗菌株的生理和生化等表型特征.

1.4.3 16S r-DNA分子鑒定 以細菌基因組DNA為模板，Primer7F：CAGAGTTTGATCCTGGCT和Primer1054R：AGGAGGTGATCCAGCCGCA為引物，進行擴增.PCR反應體系為25 μL：模板DNA 1 μL，Primer 7F和Primer 1054R各0.5 μL，dNTP 0.5 μL，10×Taqreaction Buffer 2.5 μL，Taq(5 U/μL)0.2 μL，ddH2O 19.8 μL.反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸8 min.使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，將凝膠送至上海生工生物工程有限公司進行測序，測序結(jié)果在GenBank中進行同源性比對，并使用軟件MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel2007軟件進行統(tǒng)計分析和作圖，采用SPSS19.0軟件和Duncan氏新復極差法進行多重比較.

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗細菌初篩

從蘋果樹根際土壤中分離出8個菌株，從發(fā)病枝條中分離出5個菌株，共13個菌株.對這13個菌株進行初篩，結(jié)果表明，其中5株細菌對蘋果樹腐爛病菌具有一定的拮抗作用，其中菌株QYTR-2和LZZT-1對蘋果樹腐爛病菌具有較好的拮抗作用(圖1)，其抑菌率分別達82.00%和72.00%，顯著高于其他3株細菌(表1).

2.2 拮抗細菌的復篩

通過生長速率法對菌株QYTR-2與LZZT-1進行復篩，結(jié)果表明，二者均對蘋果樹腐爛病菌具有一定拮抗作用，其中菌株QYTR-2的5倍稀釋液對腐爛病菌的抑菌率最高，達92.23%，顯著高于菌株LZZT-1(表2).

2.3 拮抗細菌的鑒定

2.3.1 形態(tài)特征及理化特性測定 菌株QYTR-2在PDA培養(yǎng)基上生長良好.28 ℃下3 d可出現(xiàn)明顯菌落.QYTR-2菌株的菌落幾乎呈圓形、乳白色、不透明、表面粗糙(圖3)，菌體桿狀，大小1.0×(2.0～4.0)μm.生理生化指標見表3.理化特性試驗結(jié)果表明，QYTR-2對接觸酶、VP試驗、D-葡萄糖產(chǎn)氣反應、肉湯反應、甲基紅反應、D-甘露醇、木糖試驗、淀粉酶反應、酪氨酸水解、硝酸還原酶、酪素分解和檸檬酸鹽利用結(jié)果均為陽性，苯丙氨酸脫氨酶反應為陰性.結(jié)合菌體培養(yǎng)特征和生理生化反應特性，QYTR-2符合寡養(yǎng)單胞菌屬Stenotrophomonas特征.

表1 從蘋果園土壤和蘋果枝條分離的細菌菌株對蘋果樹腐爛病菌的抑制作用

同列數(shù)據(jù)后不同大、小寫字母分別表示在0.01和0.05水平上差異顯著.

Data in the same column followed by different capital and small letters were significantly difference at 0.01 and 0.05 level,respectively.

A:LZZT-1；B:QYTR-2；C:CK.圖1 拮抗細菌與蘋果樹腐爛病菌對峙效果Figure 1 The confrontation effects between antagonistic bacteria and Cytospora spp.

表2 拮抗細菌不同稀釋倍數(shù)發(fā)酵濾液對蘋果樹腐爛病菌的抑制作用

A:QYTR-2 5倍液；B:QYTR-2 10倍液；C:QYTR-2 20倍液；E:LZZT-1 5倍液；F:LZZT-1 10倍液；G:LZZT-1 20倍液；D、H:CK.A:QYTR-2 5×；B:QYTR-2 10×；C:QYTR-2 20×；E:LZZT-1 5×；F:LZZT-1 10×；G:LZZT-1 20×；D、H:CK.圖2 不同稀釋倍數(shù)發(fā)酵液對蘋果樹腐爛病菌的抑制效果Figure 2 Inhibition Effects of fermentation broths with different dilution times on Cytospora spp.

2.3.2 16S r DNA序列分析 通過PCR擴增菌株QYTR-2的16S rDNA序列，片段大小1 481 bp.在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索與其具有較高相似性的參比菌株，進行序列相似性分析.使用軟件MEGA6.0將菌株QYTR-2與來自Gen-Bank的9株細菌一起構(gòu)建基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)，結(jié)果顯示QYTR-2和模式菌株嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌StenotrophomonasmaltophiliaMTCC434T(JAL V01000036)以及該屬的另一株菌StenotrophomonaspavaniiICB 89 T(FJ748683)位于同一進化分支上，其序列的同源性較高，相似值高于99%.結(jié)合形態(tài)特征和生理生化特性分析結(jié)果，將QYTR-2初步鑒定為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonasmaltophilia.

表3 篩選出的拮抗細菌菌株QYTR-2的生理生化測定結(jié)果

+：陽性反應； -：陰性反應.

+：positive reaction；-：negative reaction.

A：菌落正面；B：菌落背面.A：Colonies positive； B：Colonies back.圖3 篩選出的拮抗細菌菌株QYTR-2菌落形態(tài)特征Figure 3 Colony morphology of selected antagonistic bacterial strains QYTR-2

3 討論

拮抗細菌因其增殖速度快、易定殖、適應力強，已成為植物病害生物防治中重要的研究對象[19].拮抗細菌能形成、分泌拮抗物質(zhì)，抑制病原菌孢子萌發(fā)、導致菌絲畸形，從而控制病害發(fā)生.目前利用拮抗細菌防治蘋果樹腐爛病已有相關報道，多集中在芽孢桿菌屬(Bacillus)的一些種.黃昌華等[20-21]從小麥土壤中分離出的芽孢桿菌菌株B-HCH對小麥赤霉病和蘋果樹腐爛病均具有良好的防治作用，其發(fā)酵濾液對蘋果樹腐爛病菌抑制率達到84.10%；鄧振山等[22]分離出的G2、G9、J32和Y40四株蘋果樹內(nèi)生菌，其發(fā)酵濾液對蘋果樹腐爛病菌的抑制率均達到70.00%以上，并引起菌絲萎縮、畸形.王衛(wèi)雄等[1]從蘋果根際土壤和蘋果樹枝條上分離鑒定的枯草芽孢桿菌(B.subtilis)菌株LZ-1201和解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)菌株TS-1203，對蘋果樹腐爛病菌的抑制率分別為79.00%和85.00%，離體枝條試驗防治效果分別為74.43%和77.07%.此外，蔡光華等[23]分離得到的PG-10-8-11v拮抗細菌菌株對蘋果樹腐爛病亦具備良好的抑制作用.然而，利用寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)細菌來防治蘋果樹腐爛病鮮見報道.王彩霞等[21]從土壤中分離出與本試驗拮抗細菌相同屬的微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌(S.acidaminiphila)菌株BJ1，該菌株能有效抑制蘋果樹腐爛病菌分生孢子的萌發(fā)，并影響菌絲發(fā)育，造成菌絲畸形、分支增多及細胞質(zhì)外滲，其菌體和發(fā)酵濾液對蘋果樹腐爛病菌的抑制率分別為78.38%和70.54%，本研究篩選獲得的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(S.maltophilia)菌體和發(fā)酵液對蘋果樹腐爛病菌的抑制率分別達82.00%和92.23%，優(yōu)于菌株BJ1，這可能是由于不同種的菌株之間生長特性、分泌拮抗物質(zhì)能力等的差異性造成的.

圖4 基于16S rDNA序列構(gòu)建的菌株QYTR-2的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 4 Phylogenetic tree of strain QYTR-2 based on 16S rDNA sequence

嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(S.maltophilia)是一種革蘭氏陰性桿狀細菌，廣泛存在于土壤、水、植物根際、農(nóng)副產(chǎn)品、人體和動物體表面[24-25].本試驗從蘋果樹根際土壤分離出對蘋果樹腐爛病菌具有較高抑菌活性的菌株QYTR-2，經(jīng)鑒定為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌.當發(fā)酵濾液稀釋到5倍時，抑率菌達到了92.23%，說明該菌株產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物具有較高的抑菌活性，可以作為蘋果樹腐爛病的生防菌株，具有潛在的開發(fā)利用價值.但是，目前對該菌株僅進行了室內(nèi)抑菌效果測定，對其抑菌機理、拮抗物質(zhì)分離、離體枝條防效和田間防效等有待進一步研究.

4 結(jié)論

本研究從蘋果樹根際土壤和發(fā)病枝條中分離出13株細菌，利用菌絲生長速率法和平板對峙法，以蘋果樹腐爛病菌為目標菌，對其進行篩選.篩得的菌株QYTR-2對蘋果樹腐爛病菌具有明顯抑制作用，其5倍稀釋液抑菌率高達92.23%.通過對菌株QYTR-2的培養(yǎng)與形態(tài)觀察、生理生化測定和16S rDNA序列分析，將菌株QYTR-2鑒定為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonasmaltophilia.