抗抑郁中藥材貫葉連翹組培快繁體系建立

姚園園,呂敏,劉學(xué)周,黎潔,曹小路,張傳繼,張真,康天蘭,栗孟飛,3

(1.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省經(jīng)濟(jì)作物技術(shù)推廣站,甘肅 蘭州 730030；3.甘肅百草中藥材種植有限公司,甘肅 蘭州 730102)

貫葉連翹(HypericumperforatumL.)為藤黃科金絲桃屬多年生草本植物，又名圣約翰草(St.John’s Wort)，主要分布于甘肅、陜西、貴州等地，是我國傳統(tǒng)中藥材，具有抗菌消炎、收斂止血、消腫止痛等功效[1-2].化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，貫葉連翹地上部分(花、葉和莖)主要含有苯并二蒽酮類化合物(金絲桃素、偽金絲桃素、異金絲桃素等)、黃酮類化合物(蘆丁、槲皮素、金絲桃苷等)、間苯三酚類化合物(貫葉金絲桃素和加貫葉金絲桃素)、以及揮發(fā)油和氨基酸類等化合物[3-5].現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，以上化合物具有多種生物學(xué)活性(抗癌、抗病毒、抗氧化等作用)，尤其金絲桃素在治療輕度、中度抑郁癥方面具有顯著效果，使其成為全球研究開發(fā)的熱點(diǎn)草藥之一[4,6-9].

目前，金絲桃素主要從野生貫葉連翹植株中獲取，隨著市場對金絲桃素的需求與日俱增，使得貫葉連翹野生資源被過度采挖，已不能滿足市場需求[10].王亦菲等[11]報(bào)道稱，2007年全球金絲桃素需求量高達(dá)5萬t，而當(dāng)時(shí)市場僅能提供2萬t.為了解決原料不足的問題，很多學(xué)者就人工馴化栽培進(jìn)行了大量研究[12-14].由于貫葉連翹種子結(jié)實(shí)率低(約30%)，種子較小(長約1 mm)，到目前為止，還未能實(shí)現(xiàn)大面積推廣和種植栽培[13-16].因此，利用組培快繁技術(shù)解決種苗不足的問題對貫葉連翹大面積種植栽培具有重要意義[17].近年來，很多學(xué)者就貫葉連翹組織培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基、激素和糖的種類與濃度以及煉苗移栽工作進(jìn)行了大量研究[17-21]，已初步掌握了貫葉連翹組培快繁技術(shù)，然而，對于一個(gè)完整組培快繁體系的建立，比如，蔗糖含量、激素種類、培養(yǎng)條件以及煉苗基質(zhì)等方面的優(yōu)化選擇，還未見系統(tǒng)研究報(bào)道.因此，本研究根據(jù)貫葉連翹生物學(xué)特性，以成熟種子為外植體，進(jìn)行無菌種子苗的建立和組織培養(yǎng)，旨在為貫葉連翹大面積栽培提供充足的種苗.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以貫葉連翹成熟種子為材料，于2016年7月采自甘肅省隴南市康縣岸門口鎮(zhèn)中節(jié)村貫葉連翹種植栽培示范園(N 33°16′20″,E 105°31′50″)，風(fēng)干后保存于4℃冰箱.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子滅菌 挑選飽滿的種子，自來水沖洗10 min；置于70%乙醇中消毒2 min，無菌水沖洗3次，然后0.1% HgCl2浸泡1 min，無菌水沖洗3次；最后，用無菌吸水紙吸干種子表面水分.

1.2.2 種子發(fā)芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基與光照 以MS+4 g/L瓊脂為基本培養(yǎng)基(pH 5.8)，考察不同濃度蔗糖、活性炭和光照時(shí)間對種子發(fā)芽誘導(dǎo)的影響(表1).每個(gè)處理接種100粒種子，置于(22±1)℃的光照培養(yǎng)箱中，25 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率.

表1 種子發(fā)芽誘導(dǎo)的蔗糖、活性炭濃度與光照時(shí)間

1.2.3 地上部分生長誘導(dǎo)的外源激素 以MS+4 g/L瓊脂+20 g/L蔗糖+1 g/L活性炭為基本培養(yǎng)基(pH 5.8)，考察6-BA和NAA的不同濃度對地上部分生長誘導(dǎo)的影響(表2).每個(gè)三角瓶接種3個(gè)1.2.2中種子萌發(fā)誘導(dǎo)25 d的莖段，每個(gè)處理接種10瓶(30株).置于(22±1)℃的光照(200 lx，24 h/d)培養(yǎng)箱中，30 d后統(tǒng)計(jì)地上部分莖節(jié)數(shù).

1.2.4 生根誘導(dǎo)的外源激素 以MS+4 g/L瓊脂+20 g/L蔗糖+1 g/L活性炭為基本培養(yǎng)基(pH 5.8)，考察IAA、IBA和NAA的不同濃度(0.1、0.5、1.5、2.0 mg/L)對生根誘導(dǎo)的影響.每個(gè)三角瓶接種3個(gè)1.2.3中地上部分生長誘導(dǎo)30 d的莖段，每個(gè)處理接種10瓶(30株).置于(22±1)℃的光照(200 lx，24 h/d)培養(yǎng)箱中，30 d后統(tǒng)計(jì)根數(shù)與根長.

表2 地上部分生長誘導(dǎo)的外源激素

1.2.5 煉苗基質(zhì)的選擇 以蛭石、泥炭、珍珠巖和腐殖土為煉苗移栽基質(zhì)，考察不同混合比例(表3)對移栽成活率的影響.選取經(jīng)生根誘導(dǎo)后生長一致、長勢良好的植株，首先在室溫下敞口3 d，然后流水沖洗根系表面培養(yǎng)基，移栽至上述混合基質(zhì)中，每個(gè)處理20株.置于日照充足的通風(fēng)處煉苗，定期澆水，30 d后統(tǒng)計(jì)成活率.

表3 煉苗基質(zhì)的比例

1.3 統(tǒng)計(jì)與分析

采用Microsoft Office Excel 2007軟件作圖，SPSS 17.0軟件進(jìn)行One Way ANOVA Duncan數(shù)據(jù)差異顯著性分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基與光照對種子發(fā)芽誘導(dǎo)的影響

表4結(jié)果顯示，培養(yǎng)基與光照對種子發(fā)芽具有顯著影響，蔗糖濃度在10～30 g/L范圍內(nèi)，20 g/L發(fā)芽率最高；隨著活性炭濃度的增加，種子發(fā)芽率顯著下降；隨著光照時(shí)間的延長，種子發(fā)芽率顯著增加；最終，B處理下：MS+4 g/L瓊脂+20 g/L蔗糖+光照24 h/d條件下種子發(fā)芽率最高，達(dá)到51%，顯著高于其它處理.

2.2 外源激素對地上部分生長的影響

表5結(jié)果顯示，外源激素6-BA和NAA 9種組合下，地上部分莖節(jié)間數(shù)在B處理下：1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA下最高，其次為A處理下：1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；C處理下：1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA和E處理下：1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA莖節(jié)間數(shù)最低.

2.3 外源激素對生根的影響

表6結(jié)果顯示，不同濃度外源激素IAA、IBA和NAA對生根數(shù)和根的生長具有顯著影響，總體表現(xiàn)為IBA較IAA和NAA更有利于生根和根的伸長，其中，在2.0 mg/L和1.0 mg/L IBA下，生根數(shù)和根長分別達(dá)到4條和10 cm，均高于其它處理。綜合考慮，2.0 mg/L IBA效果較佳，生根數(shù)和根長均相對較高，分別達(dá)到4條和8 cm。

2.4 煉苗基質(zhì)對移栽成活率的影響

表7結(jié)果顯示，基質(zhì)對組培苗煉苗移栽成活率具有明顯差異，其中，B處理下：蛭石∶泥炭=1∶2煉苗成活率最高，達(dá)到85%，其次為I：蛭石∶泥炭=1∶1和泥炭∶珍珠巖=2∶1，均達(dá)到60%，而K處理下：腐殖土∶珍珠巖=1∶2、N處理下：蛭石∶泥炭∶腐殖土=2∶1∶1和O處理下：蛭石∶泥炭∶腐殖土=1∶2∶2成活率最低，僅為5%。

表4 培養(yǎng)基與光照對貫葉連翹種子發(fā)芽誘導(dǎo)的影響 Table 4 Effects of mediums and light on induction of seed germination of H.perforatum

同一因素不同小寫字母表示在P<0.05水平下達(dá)到顯著性差異.

Different lowercases indicate significant differences atP<0.05 level at the same factor.The same below.

表5 外源激素對貫葉連翹地上部分生長的影響Table 5 Effects of exogenous hormones on the growth of aerial parts of H.perforatum

同一因素不同小寫字母表示在P<0.05水平下達(dá)到顯著性差異.

Different lowercases indicate significant differences atP<0.05 level at the same factor.The same below.

表6 外源激素對貫葉連翹生根的影響Table 6 Effects of exogenous hormones on root growth of H.perforatum

同一因素不同小寫字母表示在P<0.05水平下達(dá)到顯著性差異.

Different lowercases indicate significant differences atP<0.05 level at the same factor.The same below.

表7 煉苗基質(zhì)對貫葉連翹成活率的影響Table 7 Effect of hardening matrix on the survival rate of H.perforatum

3 討論

植物組織培養(yǎng)在優(yōu)良種苗繁育、生物技術(shù)制藥、瀕危/珍稀植物保護(hù)與利用等方面已得到廣泛的應(yīng)用[22].抗抑郁中藥材貫葉連翹的組培快繁對于大面積種植栽培以及野生資源的保護(hù)具有重要意義[23].研究已表明，碳源、外源激素種類與濃度、活性炭以及培養(yǎng)環(huán)境等在組培快繁中扮演著重要角色[22].

賀軍民等[23]和李惠民[24]研究發(fā)現(xiàn)，貫葉連翹種子為典型的需光種子，其萌發(fā)需要一定濃度的激素(如赤霉素和乙烯利)和光照處理，其中，在125 lx光照強(qiáng)度和200 mg/L赤霉素處理下，種子在培養(yǎng)皿中發(fā)芽率達(dá)到92%.本研究在MS+4 g/L瓊脂+20 g/L蔗糖+光照(200 lx) 24 h/d進(jìn)行無菌誘導(dǎo)，種子發(fā)芽率最高僅為51%；這可能與種子滅菌過程中70%乙醇或者HgCl2消毒時(shí)間過長，消毒劑殘留抑制種子萌發(fā)有關(guān)[22].已有學(xué)者就外源激素促進(jìn)地上部莖葉生長進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)6-BA和IBA較有利于芽的生長以及莖段形成，其中，莖段離體培養(yǎng)30 d 后，0.5 mg/L 6-BA莖段數(shù)達(dá)10個(gè)[11]，2.0 mg/L IBA莖段數(shù)達(dá)11個(gè)[18]；本研究通過添加1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.0 g/L活性炭，培養(yǎng)30 d 后，莖段數(shù)也達(dá)11個(gè).外源激素也對根的生長具有顯著影響，莖段離體培養(yǎng)30 d 后，0.5 mg/L IBA+0.5 mg/L NAA生根率達(dá)89%[17]，0.2 mg/L IBA生根率達(dá)95%[11]，2.5 mg/L IBA根長約7 cm[18]；本研究結(jié)果表明，2.0 mg/L IBA+1.0 g/L活性炭較有利于根的生長，培養(yǎng)30 d 后，根數(shù)和根長分別達(dá)4條和8 cm.提高試管苗移栽成活率是植物離體快繁的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)[22].而煉苗營養(yǎng)基質(zhì)不僅影響成活率，而且對植株根的發(fā)生與生長以及壯苗至關(guān)重要[23-25].就貫葉連翹組培煉苗而言，僅有張東[17]和丁如賢等[20]分別以蛭石∶腐殖土(1∶1)和蛭石∶泥炭(1∶1)為基質(zhì)進(jìn)行煉苗，成活率分別為80%和64%；而沒有對營養(yǎng)基質(zhì)進(jìn)行優(yōu)化篩選.本研究以蛭石、泥炭、珍珠巖和腐殖土為煉苗基質(zhì)進(jìn)行配比優(yōu)化，結(jié)果表明蛭石∶泥炭(1∶2)植株移栽成活率最高可達(dá)85%.

4 結(jié)論

綜合結(jié)果表明，在MS+4 g/L瓊脂+20 g/L蔗糖+光照(200 lx) 24 h/d的基礎(chǔ)上，增殖培養(yǎng)添加1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.0 g/L活性炭，生根培養(yǎng)附加2.0 mg/L IBA+1.0 g/L活性炭，以及煉苗基質(zhì)采用蛭石∶泥炭(1∶2)較有利于貫葉連翹的組培快繁(圖1).該組培快繁體系的建立將對于貫葉連翹的大規(guī)模栽培、金絲桃素生產(chǎn)以及野生資源保護(hù)等方面提供理論基礎(chǔ)與技術(shù)支撐.

A：為外植體種子；B：萌發(fā)25 d的種子苗；C：繼代15 d試管苗；D：接種的單芽莖段；E：增殖30 d的試管苗；F：煉苗移栽60 d的試管苗植株.A：Images respectively represent explants seeds；B：seedlings germinated after 25 d；C：seedlings sub-cultured after 15 d；D：single-bud stems used for inoculation；E：seedlings proliferated after 30 d；F：plantlets acclimatized and transplanted after 60 d.圖1 貫葉連翹組培快繁體系Figure 1 System of tissue culture for rapid propagation of H.perforatum