一種新穎的熒光生物傳感系統(tǒng)對(duì)大腸桿菌的熒光檢測(cè)

任 樂(lè)，楊席席，韋瑞林，余 躍*

(1.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué) 附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，安徽 合肥 236001；2.合肥市第二人民醫(yī)院 消化內(nèi)科，安徽 合肥 230000)

大腸桿菌(Escherichiacoli)是一種常見(jiàn)的腸道細(xì)菌，在腸道微生態(tài)中占有重要地位[1].腸道菌群與其宿主相互作用、相互影響，直接影響著人體的健康[2].其中，E.coli被認(rèn)為可能導(dǎo)致腸易激綜合征、消化性潰瘍、炎癥性腸病、肝臟疾病等腸內(nèi)外多種疾病的發(fā)生[3-6].目前，E.coli的常規(guī)檢測(cè)方法主要有多管發(fā)酵法、濾膜法以及稀釋平板計(jì)數(shù)法等[7]，但存在著耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低、操作繁瑣等缺點(diǎn).因此，建立快速、靈敏、準(zhǔn)確的E.coli檢測(cè)方法，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值.光學(xué)生物傳感器由于具有低成本優(yōu)勢(shì)，被越來(lái)越多地用于臨床診斷.聚二乙炔(PDA)同時(shí)具有肉眼可見(jiàn)的藍(lán)-紅顏色變化和熒光響應(yīng)的特性，并且對(duì)外部刺激(如壓力、pH、溫度等)非常敏感，這使得PDA適用于熒光傳感器系統(tǒng).筆者利用靜電紡絲技術(shù)制備了一維(1D)結(jié)構(gòu)的凝膠/PDA纖維，并與E.coli及其他菌群進(jìn)行共培養(yǎng)，利用熒光顯微鏡記錄纖維產(chǎn)生的熒光，同時(shí)通過(guò)掃描電鏡(SEM)觀察纖維表面的變化，以揭示該纖維是否可用于E.coli的檢測(cè).

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑

二十戊二酸酯，分析純，日本東京化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社；HydroMed-D4(凝膠)，美國(guó)AdvanSource生物材料公司；胰蛋白酶大豆肉湯(TSB)，海博生物技術(shù)公司；四氫呋喃等試劑和溶劑，均為分析純，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)總公司；紫外可見(jiàn)吸收光譜(UV-Vis)，型號(hào)為SHIMADZU UV-2550 PC，日本島津公司；熒光顯微鏡，型號(hào)為BX-51，上海賴(lài)氏電子科技有限公司；熒光光譜儀，型號(hào)為RF-5301，日本島津公司；氙燈光源掃描電子顯微鏡(SEM)，型號(hào)為FEI Sirion200，德國(guó)蔡司集團(tuán)公司；光譜儀，型號(hào)為iHR550，日本HORIBA公司；相機(jī)，型號(hào)為DS-U2，日本尼康.

1.2 PDA紡絲制備

將含有150 mg二烯酸的溶液加入2 mL四氫呋喃中并過(guò)濾至450 mg凝膠(二乙炔(DA)/凝膠重量比1∶3)中，持續(xù)攪拌6 h，直至均勻透明.通過(guò)靜電紡絲制備含有DA的微細(xì)纖維.正極電壓為12.5 kV，負(fù)電壓為-0.5 kV，注射速度為0.5 mm·min-1，噴嘴與收集載玻片之間的距離為10 cm，溶液在噴嘴位置形成高壓電場(chǎng)“泰勒錐”，形成直徑1～3 μL的絲狀纖維.將纖維置于事先紫外線滅菌好的載玻片上.將254 nm紫外燈置于超細(xì)纖維8 cm上方，持續(xù)的紫外線照射小于或等于5 min，用于聚合纖維中的小分子DA.DA單體聚合成PDA，纖維從原來(lái)的白色聚合成藍(lán)色.將這種附著有電紡纖維的載玻片置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中備用.整個(gè)過(guò)程注意無(wú)菌操作，以防止環(huán)境中的雜菌污染對(duì)隨后實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生影響.

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)

分別將E.coli(ATCC25922)、鼠沙門(mén)氏細(xì)菌(CS093)和金黃色葡萄球菌(ATCC25923)菌落接種到新鮮胰蛋白酶大豆肉湯(TSB)中，并在37 ℃下孵育18 h至平穩(wěn)期.將400 μL培養(yǎng)物用新鮮的TSB 40 mL，并在37 ℃至中期對(duì)數(shù)期間再生長(zhǎng)(OD600=0.7).細(xì)菌細(xì)胞用新鮮胰蛋白酶大豆肉湯調(diào)整至1×107CFU·mL-1，備用.

1.4 掃描電子顯微鏡(SEM)圖像

利用2%戊二醛固定待測(cè)樣品，并用0.1 M磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，簡(jiǎn)稱(chēng)PBS)(pH 7.2～7.4)在37 ℃下靜置2 h.隨后用乙醇/水梯度(30%～100%)進(jìn)行纖維脫水，并在室溫下浸入六甲基二硅氮烷(HMDS)/乙醇梯度溶液(30%～100%)中.該過(guò)程重復(fù)7次(每個(gè)不同濃度梯度1次)，每次持續(xù)15 min.空氣干燥直到HMDS完全蒸發(fā)，脫水樣品真空干燥2 h，并用濺射裝置EMITECH K575x(Emitech Ltd，UK)鍍金.使用儀器軟件進(jìn)行操作和分析的Jeol JSM-7400F掃描電子顯微鏡(FEI Sirion200)記錄SEM圖像.

1.5 熒光顯微鏡及光波導(dǎo)

將無(wú)菌培養(yǎng)皿中附著有紡絲纖維的載玻片置于UV燈中3 min，然后將4 mL 3種不同的細(xì)菌懸浮液緩慢滴加到培養(yǎng)皿中.在含有凝膠/PDA纖維的無(wú)菌培養(yǎng)皿和等量的細(xì)菌溶液(1×107CFU·mL-1)在37 ℃下的恒溫培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng).并在顯微鏡下每2 h觀察1次，觀察纖維樣品前用蒸餾去離子水(DDW)緩慢洗滌.使用BX-51熒光顯微鏡獲得附著在纖維上的細(xì)菌誘導(dǎo)熒光顯微鏡圖像.來(lái)自氙燈的435 nm光源(Δλ=5 nm)，可見(jiàn)光強(qiáng)度為20 mW·cm-2.通過(guò)氬/氪產(chǎn)生568 nm波長(zhǎng)的激發(fā)光.發(fā)射的光通過(guò)屏障濾光片(580～700 nm).記錄640 nm激發(fā)光下不同細(xì)菌培養(yǎng)后的PDA纖維的熒光變化.最后將事先培養(yǎng)好的107CFU·mL-1E.coli菌液分別用營(yíng)養(yǎng)液逐漸稀釋至106，105，104CFU·mL-1，同時(shí)將不含有菌液的營(yíng)養(yǎng)液作為對(duì)照組，將4種濃度梯度的菌液分別取4 mL，與凝膠/PDA纖維共培養(yǎng)，觀察前先用去離子水緩慢沖洗纖維表面，然后將單個(gè)纖維置于光波導(dǎo)系統(tǒng)中進(jìn)行測(cè)定.在纖維體上發(fā)射532 nm的激發(fā)光，同時(shí)改變細(xì)菌溶液濃度，在與細(xì)菌一起培養(yǎng)6 h后測(cè)量纖維尖端耦合光的輸出強(qiáng)度的變化并記錄圖像(上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次).

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)原理及凝膠/ PDA纖維的制備和表征

圖1為凝膠/PDA纖維用于細(xì)菌熒光檢測(cè)過(guò)程示意圖.

圖1 凝膠/PDA纖維用于細(xì)菌熒光檢測(cè)過(guò)程示意圖

如圖1所示，首先用載玻片作為支撐材料，收集利用靜電紡絲技術(shù)制備的凝膠摻雜的DA纖維，進(jìn)一步通過(guò)紫外聚合成為藍(lán)相，隨后利用事先培養(yǎng)好的E.coli菌液(107CFU·mL-1)在無(wú)菌培養(yǎng)皿中和該纖維共培養(yǎng).4 h后，藍(lán)相PDA纖維出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)藍(lán)紅相轉(zhuǎn)換.當(dāng)凝膠/PDA纖維向紅相轉(zhuǎn)變時(shí)，可以檢測(cè)到纖維的熒光變化.

圖2展示了凝膠/PDA纖維與細(xì)菌孵育前后吸收峰和熒光的變化.

圖2 凝膠/PDA纖維的吸收光譜(a)和熒光光譜(b)

如圖2(a)所示，未與E.coli培養(yǎng)的藍(lán)相凝膠/PDA纖維具有的特征吸收峰在585 nm和645 nm.與起始濃度為107CFU·mL-1的E.coli菌液培養(yǎng)2 h后，藍(lán)相凝膠/PDA纖維逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榧t相，此時(shí)，紅相凝膠/PDA纖維的吸收峰偏移到500 nm和550 nm(圖2(a)).圖 2(b)展示了凝膠/PDA纖維激發(fā)熒光強(qiáng)度的變化.未與E.coli培養(yǎng)的藍(lán)相凝膠/PDA纖維不發(fā)出熒光，與E.coli共孵育后，紅色凝膠/PDA具有明顯的熒光(圖2(b)).以上結(jié)果表明，E.coli可能是引起凝膠/PDA熒光性質(zhì)變化的原因.

圖3展示了凝膠/PDA纖維與E.coli孵育前后纖維表面的變化.

(a)：E. coli培養(yǎng)前凝膠/PDA纖維的SEM圖像;(b)：E. coli培養(yǎng)后凝膠/PDA纖維的SEM圖像.圖3 E. coli孵育前后纖維表面的SEM圖像

如圖 3(a)所示，通過(guò)SEM觀察，電紡纖維的直徑約為1～3 μm.進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，與E.coli(107CFU·mL-1)孵育4 h后，E.coli可在PDA電紡纖維周?chē)じ?，并產(chǎn)生生物膜(圖3(b))，提示凝膠/PDA吸收峰和熒光強(qiáng)度的改變可能與E.coli的附著有關(guān).

2.2 凝膠/ PDA纖維對(duì)E. coli檢測(cè)的專(zhuān)屬性

進(jìn)一步觀察凝膠/PDA纖維是否可應(yīng)用于檢測(cè)不同類(lèi)的菌株(E.coli、鼠沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌)，結(jié)果如圖4所示.

(a)：凝膠/PDA纖維與不同細(xì)菌培養(yǎng)0～6 h的熒光變化；(b)：凝膠/PDA纖維與不同細(xì)菌培養(yǎng)6 h后的熒光強(qiáng)度比較.&&p<0.01，與對(duì)照組相比；##p<0.01，與鼠沙門(mén)氏菌組相比；**p<0.01，與金黃色葡萄球菌相比.圖4 凝膠/PDA纖維與不同細(xì)菌培養(yǎng)后的熒光變化

如圖4(a)所示，共培養(yǎng)2 h后，4組凝膠/PDA纖維均未觀察到明顯的熒光.4 h后，E.coli組能夠檢測(cè)到較弱的紅色熒光，隨著時(shí)間的推移，在培養(yǎng)6 h時(shí)可以觀察到明顯的紅色熒光，而其他3組在培養(yǎng)4 h和6 h時(shí)均未觀察到明顯的熒光.圖4(b)展示了培養(yǎng)6 h后各組熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)值比較，與其他3組相比，E.coli組具有更高的熒光強(qiáng)度，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p< 0.01).以上結(jié)果提示，凝膠/ PDA纖維用于E.coli的檢測(cè)具有一定的專(zhuān)屬性，可作為E.coli的高選擇性生物傳感器.

2.3 凝膠/PDA纖維對(duì)E. coli檢測(cè)的敏感性

(a)：耦合光強(qiáng)度變化隨細(xì)菌濃度變化的光波導(dǎo)系統(tǒng)示意圖；(b)：不同濃度的E. coli孵育時(shí)，532 nm激發(fā)光下凝膠/PDA纖維光波導(dǎo)照片；(c)：不同濃度梯度的E. coli對(duì)凝膠/PDA纖維耦合光強(qiáng)度的影響；(d)：在6 h時(shí)間點(diǎn)，4個(gè)濃度取對(duì)數(shù)值和凝膠/PDA纖維的耦合光強(qiáng)度的線性變化曲線.圖5 不同濃度梯度的E. coli對(duì)凝膠/PDA纖維光波導(dǎo)成像的影響

進(jìn)一步觀察不同濃度梯度的E.coli對(duì)凝膠/PDA纖維光波導(dǎo)成像的影響，結(jié)果如圖5所示.由圖5(a)～(c)所示，隨著E.coli濃度的增加，凝膠/PDA纖維輸出端端口耦合光的強(qiáng)度隨著E.coli濃度(104～ 107CFU·mL-1)的增加而增強(qiáng).并且，濃度的對(duì)數(shù)值和纖維尖端的耦合光強(qiáng)度間呈線性關(guān)系(Y=42.328X-420.633，圖5(d))，這種線性關(guān)系進(jìn)一步表明了凝膠/PDA纖維的熒光變化是由E.coli引起，為臨床上通過(guò)凝膠/PDA纖維檢測(cè)E.coli提供了一定的理論依據(jù).

3 討 論

研究中，筆者利用靜電紡絲技術(shù)制備了一維(1D)結(jié)構(gòu)的凝膠/PDA纖維，其制備過(guò)程快速，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，成本低，適合大規(guī)模商業(yè)化的生產(chǎn)和應(yīng)用.PDA作為生物傳感器常用的一種材料，由于成本低，近年來(lái)被越來(lái)越多地用于細(xì)菌的快速檢測(cè)[8].PDA對(duì)外部刺激(壓力、pH、溫度等)非常敏感，具有肉眼可見(jiàn)的藍(lán)紅相轉(zhuǎn)變和外界刺激誘導(dǎo)下產(chǎn)生熒光的兩種特性，使得PDA更適用于基于熒光激發(fā)的傳感器系統(tǒng).因此，利用PDA以上的特性，該研究設(shè)計(jì)的凝膠/PDA纖維被發(fā)現(xiàn)可方便快捷地應(yīng)用于E.coli的檢測(cè).目前，關(guān)于E.coli的檢測(cè)光學(xué)生物傳感器還包括氧化多孔硅納米材料，可實(shí)現(xiàn)對(duì)103CFU·mL-1的E.coli快速、靈敏和可重復(fù)的檢測(cè)[9].與該納米材料相比，雖然該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的凝膠/PDA纖維靈敏度略低(104CFU·mL-1)，但是與納米材料高昂的成本相比，該研究使用的PDA材料成本非常低，可應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)，并且在后續(xù)的研究中，將通過(guò)純化E.coli、減少外界環(huán)境的干擾等措施，逐步提高凝膠/PDA纖維的靈敏度.另外，傳統(tǒng)的E.coli檢測(cè)方法耗時(shí)較長(zhǎng)且操作復(fù)雜，不適合大批量樣品的檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)還會(huì)造成診治的延誤，該研究設(shè)計(jì)的凝膠/PDA纖維僅僅需要4～6 h就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)E.coli的檢測(cè)，并且操作步驟簡(jiǎn)單易掌握，適合醫(yī)技人員的使用.

筆者利用纖維作為整合材料，易于小型化，可以進(jìn)一步集成到芯片中以實(shí)現(xiàn)便攜式診斷.纖維可以用作有源光波導(dǎo)，允許局部激發(fā)的光沿著其進(jìn)行傳播.近年來(lái)，研究人員利用這種纖維波導(dǎo)傳感器系統(tǒng)進(jìn)行了大量的科研和檢測(cè)工作[10-12]，其具有幾個(gè)顯著的特點(diǎn)：第一，凝膠/PDA纖維中的激發(fā)位置和輸出耦合位置位于纖維的兩端，因此有助于減少環(huán)境熒光的干擾.凝膠/PDA纖維的波導(dǎo)傳感器可以應(yīng)用于復(fù)雜的化學(xué)和生物環(huán)境中.第二，1D的凝膠/PDA纖維結(jié)構(gòu)中的高表面體積比有利于分析物分子的擴(kuò)散，有利于細(xì)菌表面物質(zhì)變化的瞬間捕獲以及記錄熒光淬滅過(guò)程中的波導(dǎo)變化.

使用另外兩種常見(jiàn)的菌種鼠沙門(mén)氏細(xì)菌和金黃色葡萄球菌作為對(duì)比組，進(jìn)一步利用該光學(xué)生物傳感系統(tǒng)觀察對(duì)E.coli的特異性檢測(cè).結(jié)果顯示，鼠沙門(mén)氏細(xì)菌組和金黃色葡萄球菌組在與凝膠/PDA纖維共培養(yǎng)后，幾乎觀察不到熒光的產(chǎn)生，而E.coli組則表現(xiàn)出較高的熒光強(qiáng)度，提示凝膠/PDA纖維可特異性地應(yīng)用于E.coli的檢測(cè).隨后利用不同濃度梯度的E.coli和凝膠/PDA纖維孵育，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著E.coli濃度的增加，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，并且存在線性關(guān)系.分析特異性和相關(guān)性發(fā)生的原因，可能是由于E.coli產(chǎn)生的生物膜和/或由膜活性細(xì)菌分泌物引起.這些活性物質(zhì)可能是目前被廣泛研究的E.coli標(biāo)記物和公認(rèn)的毒力因子.如乳鐵蛋白B，即通過(guò)胃乳糖酶消化牛乳鐵蛋白產(chǎn)生的肽，在pH 5.5～7.5的范圍內(nèi)與E.coli的活性存在一定的關(guān)聯(lián)[13].另外，E.coliα-溶血素的鈣依賴(lài)性構(gòu)象轉(zhuǎn)變[14]、細(xì)菌表面膜中的脂質(zhì)以及細(xì)菌產(chǎn)生的毒素等[15]均被認(rèn)為可以間接反映E.coli的活性，可作為用于E.coli的檢測(cè)指標(biāo).因此，這些分泌物可能是E.coli誘導(dǎo)凝膠/PDA纖維產(chǎn)生熒光的原因和機(jī)制所在，需要進(jìn)一步的研究加以論證.

綜上所述，該研究成功開(kāi)發(fā)了一種用于檢測(cè)E.coli的新型光波導(dǎo)傳感器.該微米纖維具有成本低、制備工藝簡(jiǎn)單、材料靈活性好、應(yīng)用廣泛等優(yōu)異性能.另外，這種光波導(dǎo)系統(tǒng)由于尺寸小，預(yù)計(jì)未來(lái)可以進(jìn)一步整合到芯片中用于E.coli感染的臨床診斷.