一株高效好氧反硝化細(xì)菌的分離鑒定及脫氮性能研究

李文甫 杜柳冰，2 劉思瑩 翁美遂 舒琥 陳瓊?cè)A

（1. 廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510006；2. 中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣州 510000）

高密度集約化的池塘養(yǎng)殖模式常會引起水質(zhì)污染，特別是水體氨氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮等嚴(yán)重超標(biāo)，對水生動物有直接且嚴(yán)重的毒害作用，造成經(jīng)濟(jì)巨大損失［1-5]。針對現(xiàn)階段養(yǎng)殖池塘的嚴(yán)重問題，生物脫氮是一種有效途徑［6]。傳統(tǒng)生物脫氮一般認(rèn)為硝化作用是好氧的自養(yǎng)過程，反硝化作用是嚴(yán)格或兼性厭氧的異養(yǎng)過程［7]，使得需要單獨(dú)設(shè)置缺氧單元，增加成本和管理難度。

20世紀(jì)80年代，Robertson等［8]報(bào)道了好氧反硝化細(xì)菌和好氧反硝化酶系存在，可在有氧條件下進(jìn)行硝化和反硝化過程。后來研究者們從污水處理設(shè)施、魚塘、稻田等環(huán)境中分離出好氧反硝化菌［9-10]。Srinandan等［11]從污水處理廠污泥樣品中分離出高效反硝化功能的叢毛單胞菌屬（Comamonassp.）和假單胞菌（Pseudomonassp.）；成鈺等［12]從刺參養(yǎng)殖環(huán)境中分離出具有異養(yǎng)硝化和好氧反硝化的花津?yàn)┭挎邨U菌（Bacillus hwajinpoensis）；王田野等［13]從長期施用農(nóng)家肥的土壤中篩選出一株屬不動桿菌（Acinetobactersp.）的耐高氨氮脫氮菌株等［11-13]。這種新型脫氮菌株極大改良了傳統(tǒng)生物脫氮的不足，異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細(xì)菌已成為目前生物脫氮研究熱點(diǎn)。但現(xiàn)階段研究水平所分離的脫氮菌株，仍然具有如脫氮周期長，降氮形式單一等不足之處。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品 廣東省廣州市西朗珠江水產(chǎn)所養(yǎng)殖池池水及底泥。

1.1.2 培養(yǎng)基 BTB 培養(yǎng)基［14]（g/L）：KH2PO41.5 g，MgSO4·7H2O 0.01 g，Na2HPO47.9 g，檸檬酸鈉 5.66 g，NaNO30.8415 g，NH4Cl 0.192 g，NaNO20.362 g，微量元素溶液 2 mL，BTB溶液1 mL，瓊脂 25 g，H2O 1 000 mL，pH 7.0-7.5；反硝化培養(yǎng)基（g/L）：KNO30.53 g，檸檬酸鈉3.0 g，KH2PO40.25 g，Na2HPO40.3 g，MgSO4·7H2O 1 g，瓊脂 20 g，H2O 1 000 mL，pH 7.0；牛肉膏蛋白胨硝酸鹽培養(yǎng)基［15]（g/L）：牛肉膏5 g，蛋白胨 10 g，KNO31 g，NaCl 5 g，瓊脂 20 g，H2O 1 000 mL，pH 7.2-7.4；DM發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：KH2PO41.5 g，MgSO4·7H2O 0.01 g，Na2HPO47.9 g，檸檬酸鈉5.66 g，微量元素溶液 2 mL，NH4Cl 0.603 6 g（或 NaNO30.959 0 g 或 NaNO20.375 g），H2O 1 000 mL，pH 7.2。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離純化 稱取泥樣10 g和水樣10 mL分別用無菌水稀釋制備成10-1稀釋液，取0.1 mL在新鮮BTB、反硝化和牛肉膏蛋白胨硝酸鹽培養(yǎng)基中涂布，28℃恒溫培養(yǎng)2-3 d，挑取單菌落劃線3-4次，鏡檢驗(yàn)純并斜面保種于4℃冰箱。

1.2.2 脫氮性能菌株的初篩 純化菌株接種于BTB反硝化鑒定培養(yǎng)基培養(yǎng)1-2 d，根據(jù)生長情況和培養(yǎng)基顏色圈大小情況篩選出具有反硝化能力的菌株；再將篩得菌株接種異養(yǎng)硝化鑒定培養(yǎng)基于28℃，180 r/min培養(yǎng)2 d，利用格里斯試劑檢測篩得具硝化能力的菌株。

1.2.3 脫氮性能菌株的復(fù)篩 將1.3.2得到的菌株取3環(huán)活化斜面接種于營養(yǎng)肉湯以28℃，180 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)1 d，測其OD600值，以1%接種量再接至以氨氮（NH4-N）、硝態(tài)氮（NO3-N）以及亞硝態(tài)氮（NO2-N）作為唯一氮源的DM發(fā)酵液中以28℃，180 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)，于0 h、24 h和48 h取發(fā)酵液液測其OD600值，并以5 000 r/min，5 min離心處理，測氨氮（NH4-N）、硝態(tài)氮（NO3-N）以及亞硝態(tài)氮（NO2-N）的含量。

1.2.4 硝化性能及反硝化性能測定 選擇復(fù)篩后高性能菌株BB-17作為目標(biāo)菌株，取斜面3環(huán)活化斜面接種于100 mL含氨氮（NH4-N）、硝態(tài)氮（NO3-N）以及亞硝態(tài)氮（NO2-N）作為唯一氮源的種液中以28℃，180 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)1 d并測其OD600值；再以1%的接種量接種于含對應(yīng)種液不同氮源發(fā)酵液中以28℃，180 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)2 d。于0 h、6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h 和 48 h 取樣液測其OD600值，以5 000 r/min，5 min離心處理，取其上清液測其總氮（TN）、氨氮（NH4-N）、硝態(tài)氮（NO3-N）以及亞硝態(tài)氮（NO2-N）的含量。

1.2.5 氮素檢測方法及去除率計(jì)算 氨氮（NH4-H）采用納氏試劑分光光度法（GB HJ535-2009）測定；硝態(tài)氮（NO3-N）采用紫外分光光度法（GB HJ/T346-200）測定；亞硝態(tài)氮（NO2-N）采用N-（1-萘基）-乙二胺二鹽酸鹽分光光度法（GB 7493-87）測定；總氮（TN）采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法（GB HJ636-2012）測定。去除率的計(jì)算公式如下：

式中：C0表示0 h相應(yīng)氮源濃度（mg/L），Ci表示發(fā)酵培養(yǎng)后某時(shí)間相應(yīng)氮源濃度（mg/L）。每組設(shè)置3組平行，采用Excel對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與繪圖。

在治療期間所有患者禁止食用難以消化、油膩性、刺激性的食物,對照組患者采用常規(guī)藥物治療,即口服嗎丁啉,10mg/次,一天三次[2]。研究組患者加強(qiáng)針刺穴位治療,其具體如下:取雙側(cè)四縫穴,位置在第二到第五指掌面,第一、二節(jié)橫紋中央。用五號、六號注射針頭,左手扶住手指,刺手快速點(diǎn)刺。點(diǎn)刺深淺根據(jù)年齡、體質(zhì)決定,刺后用雙手?jǐn)D出少許血液或淋巴液即可。取坐位,雙手伸開,常規(guī)消毒,將五號、六號注射針頭,垂直、快速的刺入穴位,快速起針,不用留針。

1.2.6 菌株形態(tài)學(xué)鑒定 接種菌株到營養(yǎng)瓊脂平板中28℃培養(yǎng)24 h，觀察單菌落的生長情況，染色鏡檢觀察菌體形態(tài)特征并拍照記錄。

1.2.7 菌株16S rDNA分子鑒定 以細(xì)菌基因組DNA為模板擴(kuò)增其16S rDNA，擴(kuò)增采用一對通用引物：上游引物（27F）：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；下游引物（1492R）：5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3'。DNA模板提取采用TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR裂解酶，取20 μL 于滅菌PCR管中，用滅菌槍頭挑取單菌落至于管中攪動后取出，80℃金屬浴15 min，低速離心取上清液作為模板。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：上海翊圣生物2×HieffTMPCR Master Mix（With Dye）25.0 μL，上游引物和下游引物各 2.5 μL，DNA 模板 5 μL，無酶水 15 μL。PCR 程序如下 ：（1）94℃預(yù)變性，5 min；（2）94℃變性，1 min ；（3）55℃退火，1 min ；（4）72℃延伸1.5 min；（5）72℃，8 min；（2）-（4）步循環(huán) 30 次。瓊脂糖凝膠電泳（1×TBE電泳緩沖液，1%瓊脂糖）分析PCR結(jié)果。PCR產(chǎn)物的純化和測序由上海生物工程有限公司完成，測序結(jié)果通過ExBioCloud進(jìn)行比對分析，并利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 分離純化與初篩的菌株

經(jīng)3種篩選培養(yǎng)基分離純化出的菌株的平板初篩，初步獲得82株生長狀態(tài)良好并具有利用培養(yǎng)基中氨氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮的菌株。利用BTB反硝化鑒定培養(yǎng)基的顯色反應(yīng)，以及格力斯試劑檢測顏色深淺情況，初步篩選具有反硝化能力的菌株共有51株，占篩選出細(xì)菌總數(shù)62.20%，而具有硝化能力的菌株共有31株，占篩選出細(xì)菌總數(shù)37.80%。其中，既具有反硝化能力又兼有硝化能力的菌株共有16株，占篩選出細(xì)菌總數(shù)19.51%。不同培養(yǎng)基分離純化結(jié)果如表1所示，牛肉膏蛋白胨硝酸鹽培養(yǎng)基共篩得17株，占總數(shù)20.73%；反硝化培養(yǎng)基篩得29株，占總數(shù)35.37%；BTB培養(yǎng)基篩得36株，占總數(shù)43.90%。其中由BTB培養(yǎng)基篩得泥樣的降氮能力數(shù)量最多。

表1 不同培養(yǎng)基分離純化的菌株

2.2 菌種降氮性能復(fù)篩結(jié)果

對2.1初篩獲得菌株，以氨氮，硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮為唯一氮源進(jìn)行脫氮能力測定。如圖1-3所示，其中大多數(shù)菌株在氨氮為唯一氮源的培養(yǎng)基中生長良好，大部分在24 h達(dá)到生物最大量并在48 h下降。由圖1和圖2可見，多數(shù)菌株在氨氮和硝態(tài)氮唯一培養(yǎng)基中生長良好，但相對其他兩種氮源更多的菌株在單一亞硝態(tài)氮中生長較為緩慢。

圖1 不同菌株在氨氮為唯一氮原的培養(yǎng)基中的生長情況

不同菌株的脫氮情況見表2，篩得多數(shù)菌株能夠高效利用氨氮和亞硝態(tài)氮，其中FA1、FA2、BB1和BB17在48 h能夠?qū)Π钡到膺_(dá)到高于90%，BB1、BB17和BB3在48 h能夠?qū)喯鯌B(tài)氮降解達(dá)到高于99%，相比菌株對于氨氮和亞硝態(tài)氮的利用，大多數(shù)菌株對硝態(tài)氮的去除能力不強(qiáng)，更多地表現(xiàn)為對氨氮或亞硝態(tài)氮的攝取降解。

圖2 不同菌株在硝態(tài)氮為唯一氮原的培養(yǎng)基中的生長情況

圖3 不同菌株在亞硝態(tài)氮為唯一氮原的培養(yǎng)基中的生長情況

表2 不同菌株搖瓶48 h的OD600值及其脫氮率

2.3 高效菌株BB-17的脫氮特性研究

在2.2所得到的復(fù)篩結(jié)果中，選擇一株性能明顯且高效的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株BB-17，進(jìn)行以NH4Cl、NaNO3和NaNO2為唯一氮源的脫氮性能測定。

2.3.1 BB-17菌株對NH4Cl的脫氮特性 以NH4Cl為唯一氮源，BB-17菌株生長狀況及其脫氮特性如圖4所示。菌株在經(jīng)歷約6 h遲緩期后生長速度急劇上升進(jìn)入對數(shù)期，在18 h時(shí)OD600到達(dá)生物最大量。18 h后菌量出現(xiàn)緩慢下降。在菌株遲滯期間，氨氮去除率趨于平緩，隨著菌株進(jìn)入生長對數(shù)期，氨氮去除率隨后在6 h到18 h急劇上升，并達(dá)到最大值93.92%，此時(shí)氨氮濃度達(dá)到最低，在18 h后去除率開始緩慢下降?？偟コ逝cOD600和氨氮去除率趨勢基本一致，都體現(xiàn)為先升高，在第18 h到最大值68.96%，再降低，30 h后總氮去除率趨于平緩。由于菌株的硝化作用，將培養(yǎng)液中唯一氮源NH4Cl轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽和硝酸鹽，菌株能夠快速利用氨氮來自身合成生長所需物質(zhì)，在18 h利用率達(dá)到最高，而氨氮濃度也達(dá)到最低。在后續(xù)生長過程中，亞硝酸鹽的積累也可能影響菌株的生長，理化性質(zhì)改變可能導(dǎo)致細(xì)菌自身大量分解，釋放菌體內(nèi)自身氮源，從而使總氮含量短時(shí)間內(nèi)回升，總氮去除率下降。在30 h之后，培養(yǎng)液中總氮去除率相對處于平緩狀態(tài)。

2.3.2 BB-17菌株對NaNO3的脫氮特性 以NaNO3為唯一氮源，BB-17菌株生長狀況及其脫氮特性如圖5所示。菌株在經(jīng)歷約6 h遲緩期后，生長速度在6 h到12 h期間開始緩慢上升進(jìn)入對數(shù)期，在12 h到18 h期間生長速度急劇上升并在18 h時(shí)OD600達(dá)到生物最大量。18 h后菌量緩慢下降，下降至36 h后呈現(xiàn)平緩。硝態(tài)氮降解率隨著菌株進(jìn)入對數(shù)期而升高，在0 h到18 h與OD600趨勢大致相同，24 h后，硝態(tài)氮去除率趨于平緩，直到42 h又開始緩慢上升，在48 h達(dá)到最大去除率66.11%。總氮去除曲線與菌株生長曲線趨勢基本一致，呈現(xiàn)為0 h到12 h升高到達(dá)降解最大值49.32%，12 h后緩慢下降，在42 h后出現(xiàn)回升。在以NaNO3唯一氮源培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，因菌株的反硝化作用，培養(yǎng)體系中有亞硝態(tài)氮生成，菌株需要再適應(yīng)并后續(xù)利用其作為氮源合成營養(yǎng)物質(zhì)，因而生長狀態(tài)較為緩慢。

圖5 BB-17菌株在以NaNO3為唯一氮源的培養(yǎng)基中的生長曲線及硝態(tài)氮和總氮降解情況

2.3.3 BB-17菌株對NaNO2的脫氮特性 以NaNO2為唯一氮源，BB-17菌株生長狀況及其脫氮特性如圖6所示。菌株在經(jīng)歷約18 h的遲緩期后，生長速度由18 h到24 h的緩慢上升，到24 h到36 h急速上升，并在36 h后生長速度減慢趨于穩(wěn)定，在42 h 時(shí)OD600達(dá)到生物最大量。42 h后菌量開始下降。亞硝態(tài)氮去除率曲線與生長曲線趨勢大致相同，0 h到18 h趨于平緩，18 h到36 h去除率大快上升，36 h后趨于穩(wěn)定，在48 h處達(dá)到最大值99.11%?？偟コ逝c生長曲線趨勢大致相同，呈現(xiàn)從0 h到36 h先升高達(dá)到最大值74.33%。36 h后總氮降解率開始下降。菌株適應(yīng)期較長有可能是因?yàn)槌跏紒喯鯌B(tài)氮濃度過高，后期由于菌株的反硝化作用，利用培養(yǎng)液中唯一氮源NaNO2，菌株適應(yīng)環(huán)境后，能夠快速利用亞硝態(tài)氮來自身合成生長所需物質(zhì)。

圖6 BB-17菌株在以NaNO2為唯一氮源的培養(yǎng)基中的生長曲線及亞硝態(tài)氮和總氮降解情況

2.3.4 BB-17菌株形態(tài)學(xué)鑒定 如圖7所示，BB-17在營養(yǎng)瓊脂平板上為圓形米白色菌落，邊緣整齊不透明，表面光滑濕潤，具有黏性。

圖7 BB-17菌株平板菌落形態(tài)特征

如圖8及圖9所示，BB-17經(jīng)染色鏡檢為短桿菌，無芽孢革蘭氏陰性，圖中箭頭所指即其端生鞭毛。

圖8 BB-17菌株單染色鏡檢圖

2.3.5 BB-17 16S rDNA鑒定及其同源性分析 以細(xì)菌基因組DNA為模板，27F和1492R為上下游引物擴(kuò)增其16S rDNA，并以不加入菌體DNA模板的PCR產(chǎn)物作為陰性對照，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖10，在1 500 bp左右處得到一條單一、明亮的條帶。將PCR 產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司測序，所得序列經(jīng)過EzBioCloud數(shù)據(jù)庫比對分析，與Pseudomonas vancouverensis（AJ011507）具有98.41%同源性，可初步確定BB-17為假單胞菌屬，并將其命名為Pseudomonassp. BB17。

圖9 BB-17菌株鞭毛染色鏡檢圖（箭頭所指即為鞭毛）

圖10 BB-17菌株16S rDNA PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜

將Ezbiocloud數(shù)據(jù)庫上與BB-17 16S rDNA序列比對具有最高相似度的Pseudomonas vancouverensis、P. moorei、P. umsongensis和P. mohnii等菌株通過MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖11所示。BB-17菌株與P. vancouverensis（AJ011507）在進(jìn)化上具有較高的同源性，但由于其16S rDNA匹配度并不高，BB-17有可能是新菌種，但仍需結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化特征進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。

3 討論

異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌在自然界中廣泛存在，現(xiàn)已在多種環(huán)境中分離純化得到。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)方法，在含氮養(yǎng)殖池水中分離篩選得到具有高性能異養(yǎng)硝化-好氧反硝化能力菌株，其中具有高效脫氮能力的細(xì)菌大多數(shù)在塘泥當(dāng)中，在水中能夠脫氮的細(xì)菌的數(shù)量較少。使用3種不同氮源組成的培養(yǎng)基以模擬多種不同氮源環(huán)境搖瓶測定脫氮性能，得到數(shù)量可觀的高性能菌株。并以一株性能明顯的BB-17菌株作為對象，測定該菌株在3種唯一氮源的培養(yǎng)基中發(fā)酵的脫氮性能，BB-17其對于總氮（TN）、氨氮（NH4-N）、硝態(tài)氮（NO3-N）以及亞硝態(tài)氮（NO2-N）4個(gè)指標(biāo)均有良好的脫氮性能。結(jié)合形態(tài)學(xué)和16S rDNA序列比對的方法，初步鑒定BB-17菌株屬于假單胞菌屬（Pseudomonassp.），并對該菌株命名為Pseudomonassp.BB17。

本方法從養(yǎng)殖池塘篩得菌株具有高效脫氮能力。篩選得到的菌株在24 h左右達(dá)到生物最大量和最大脫氮率。其中高性能菌株BB-17具有優(yōu)秀的高效脫氮性能。在發(fā)酵培養(yǎng)中，BB-17菌株在以NH4Cl為唯一氮源的DM培養(yǎng)基中生長速度最快，以NaNO3為唯一氮源其次，在以NaNO2唯一氮源的則生成速度較慢。BB-17在以NH4Cl為唯一氮源的DM培養(yǎng)基中氨氮去除情況在18 h達(dá)到最大值93.92%，而在以NaNO3為唯一氮源的DM培養(yǎng)基中硝態(tài)氮去除情況在48 h達(dá)到最大值66.11%，另外在以NaNO2為唯一氮源的DM培養(yǎng)基中亞硝態(tài)氮去除情況在48 h達(dá)到最大值99.10%，不同之處在于生長周期不同，氨氮培養(yǎng)基中BB-17在18 h達(dá)到單一氮源下的生物最大量，在硝態(tài)氮培養(yǎng)基中與氨氮培養(yǎng)基基本一致，但在亞硝態(tài)氮培養(yǎng)基中生長緩慢，約于42 h達(dá)到生物最大量。所得結(jié)果與牟東陽等從活性淤泥中分離篩選出P.sp.DK1 情況類似，相比于沈輝等［17]從海洋分離得到的鹽單胞菌屬Halomonas和產(chǎn)堿桿菌屬Alcaligenesx細(xì)菌和菜鈺穎等［18]從活性污泥中所分離的生長周期約6 d的菌株，BB-17均有達(dá)到生物最大量時(shí)間短和脫氮率高等優(yōu)點(diǎn)［16-18]。但在不同氮源中BB-17對于脫氮能力的表現(xiàn)并不相同。結(jié)合BB17的生長情況分析比較，原因可能是菌株對不同氮源的適應(yīng)性不同，對不同氮源的利用能力也有所不同［19-21]。不同氮源培養(yǎng)基中總氮降解率的差距在于菌株對不同氮源適應(yīng)性以及利用率的問題，也可能是菌株的硝化性能以及反硝化性周期規(guī)律性問題，同時(shí)也存在于培養(yǎng)體系因取樣問題而減少，導(dǎo)致降氮情況有所改變也不排除培養(yǎng)體系減少而導(dǎo)致生長體系中營養(yǎng)物質(zhì)減少、代謝廢物過多的可能。綜上所述，高性能菌株BB-17在初步搖瓶發(fā)酵探究其脫氮性能中，表現(xiàn)出優(yōu)秀的特性，主要包括菌株生長速度快、脫氮周期短、降氮類型多樣和降解能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，為后續(xù)應(yīng)用于實(shí)際廢水的脫氮研究提供重要的理論指導(dǎo)意義。

圖11 基于16S rDNA序列同源性構(gòu)建BB-17菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

4 結(jié)論

本研究從廣州市西朗珠江水產(chǎn)所養(yǎng)殖池池水及底泥中分離純化得到16株異養(yǎng)硝化好氧反硝化菌株，從中篩選得到1株高效脫氮的菌株BB-17。測定其在單一氮源培養(yǎng)基發(fā)酵的生長曲線和脫氮性能，顯示菌株BB-17在28℃培養(yǎng)48 h，基本在6-24 h內(nèi)到達(dá)生長對數(shù)期，其氨氮去除率在18 h可達(dá)93.92%，硝態(tài)氮去除率在48 h可達(dá)66.11%，亞硝態(tài)氮去除率在48 h可高達(dá)99.10%。經(jīng)過鑒定BB-17為革蘭氏陰性短桿菌，16S rDNA序列分析結(jié)果與Pseudomonas vancouverensis（AJ011507） 比 對 具 有98.41%同源性，確定BB-17為假單胞菌屬并命名為Pseudomonassp. BB17。