一株耐鹽對(duì)硝基苯酚降解菌的分離及其降解機(jī)理研究

任磊 劉斌 藺中 甄珍 劉月廉 胡漢橋 閆艷春

（1. 廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湛江 524088；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081）

硝基酚類化合物是一類重要的化工原料，是精細(xì)化工產(chǎn)品生產(chǎn)的重要中間體，被廣泛地應(yīng)用于染料、農(nóng)藥、醫(yī)藥、合成材料、機(jī)械和木材防腐等領(lǐng)域［1]。其中，單硝基酚類化合物包括鄰硝基苯酚（orthonitrophenol，ONP）、間硝基苯酚（meta-nitrophenol，MNP）和對(duì)硝基苯酚（para-nitrophenol，PNP）3類，以PNP使用范圍最廣、使用量最大［2-3]。對(duì)硝基苯酚可通過不同途徑進(jìn)入環(huán)境，已成為環(huán)境中硝基酚類污染物典型代表之一。大多數(shù)硝基芳烴化合物有致癌、致畸及致突變作用，一些硝基化合物經(jīng)過肝臟和腸道微生物代謝還可生成致癌物質(zhì)和致癌物質(zhì)的前體［4]。由于對(duì)硝基苯酚具有良好的水溶性，導(dǎo)致其很容易隨水體流動(dòng)進(jìn)行遷移而易進(jìn)入地下水系統(tǒng)，且在深層土壤和地下水中持留較長(zhǎng)時(shí)間［5]。同時(shí)，由于對(duì)硝基苯酚在較低濃度（＜10 μmol/L）條件下，就可解除呼吸鏈氧化磷酸化過程，從而改變細(xì)胞代謝過程，因此對(duì)人體健康及環(huán)境生物具有較大威脅［6]。對(duì)硝基苯酚已被美國環(huán)保署（US EPA）列為優(yōu)先控制污染物之一，在我國也被列入水中優(yōu)先控制污染物黑名單［7]。

對(duì)硝基苯酚高效降解方法的探索一直是國內(nèi)外研究熱點(diǎn)之一，研究較多的包括吸附法、氧化法、生化法以及生物降解法［8-10]。對(duì)于生物降解而言，具有較好環(huán)境適應(yīng)性的降解菌的分離為生物降解及環(huán)境修復(fù)等相關(guān)生物技術(shù)提供了重要的菌種資源，降解相關(guān)基因的克隆與功能驗(yàn)證為降解工程菌的構(gòu)建及固定化酶技術(shù)等提供了重要基因資源。本研究以對(duì)硝基苯酚為底物，從長(zhǎng)期受生活廢水污染的近海灘涂分離獲得了高效對(duì)硝基苯酚降解菌RL-JY1，對(duì)菌株進(jìn)行了系統(tǒng)的鑒定與環(huán)境適應(yīng)性分析，并對(duì)菌株RL-JY1降解對(duì)硝基苯酚的代謝途徑及相關(guān)分子機(jī)制進(jìn)行了探索，以期豐富硝基酚類降生物降解的微生物與基因資源，為硝基酚類化合物的生物降解提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 本研究所使用的降解菌RL-JY1為本實(shí)驗(yàn)室分離獲得，目前已保存于廣東省微生物菌種保藏中心（保存編號(hào)：GDMCC 60494）；使用的感受態(tài)細(xì)胞Escherichia coliDH5αDTA克隆用載體（pMD19-T）均購自TaKaRa公司。

1.1.2 試劑 對(duì)硝基苯酚（分析純，95%）購于百靈威科技，溶于色譜純甲醇（購自Fisher公司）并調(diào)整濃度至1×105mg/L作為儲(chǔ)備液，待使用時(shí)根據(jù)需要添加并調(diào)整至目標(biāo)濃度；酵母提取物、蛋白胨、瓊脂粉等配制培養(yǎng)基所需的主要成分均購自O(shè)xoid公司；基因組提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、連接轉(zhuǎn)化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒等均購自TaKaRa公司；PCR引物合成及DNA測(cè)序均委托英濰捷基公司完成；甲醇與乙腈均為色譜純，購自Fisher公司；其余試劑與耗材均購自國內(nèi)廠家。

1.1.3 培養(yǎng)基 無機(jī)鹽離子培養(yǎng)基（MSM）：（NH4）2SO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，CaCl20.01 g/L，KH2PO41.5 g/L，K2HPO41.5 g/L，Na2HPO4·12H2O 1.5 g/L，NaCl 10.0 g/L，定容至指定體積后滅菌備用。

富集培養(yǎng)基（EM）：蛋白胨 5 g/L，酵母粉 5 g/L，KH2PO41.5 g/L，K2HPO41.5 g/L，NaCl 10.0 g/L， 定容至指定體積后滅菌備用。

LB培養(yǎng)基（LB）：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，定容至指定體積后滅菌備用。

以上培養(yǎng)基均使用NaOH或HCl調(diào)整pH至7.0，添加瓊脂粉至1.5%（W/V）即得固體培養(yǎng)基，所有培養(yǎng)基均在121℃滅菌25 min后備用。

1.2 方法

1.2.1 對(duì)硝基苯酚降解菌的富集與分離 土樣和海水樣品均采自廣東省湛江市霞山區(qū)附近海域?yàn)┩浚ū本?21° 12' 29″，東經(jīng) 110° 24' 55″）。取 5 g土樣或 5 mL水樣，加入100 mL新鮮的MSM培養(yǎng)基中，并添加對(duì)硝基苯酚至50 mg/L，培養(yǎng)液于30℃，180 r/min條件下培養(yǎng)（避光培養(yǎng)）。培養(yǎng)5 d后，取5 mL的培養(yǎng)液加入100 mL新鮮的MSM培養(yǎng)基中，添加并提高對(duì)硝基苯酚至100 mg/L，培養(yǎng)液于30℃，180 r/min條件下培養(yǎng)（避光培養(yǎng)）。重復(fù)此操作，每次提高對(duì)硝基苯酚濃度50 mg/L至培養(yǎng)液中初始對(duì)硝基苯酚濃度達(dá)到500 mg/L。

選取黃綠色消失的培養(yǎng)液（對(duì)硝基苯酚易溶于水，呈黃綠色），將獲得的培養(yǎng)液劃線培養(yǎng)至MSM固體培養(yǎng)基（含100 mg/L對(duì)硝基苯酚）上，獲得平板于30℃條件下避光培養(yǎng)。每12 h對(duì)平板進(jìn)行一次觀測(cè)，至平板上長(zhǎng)出較多單菌落后，挑取單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h（30℃，180 r/min）后取 1 mL菌液離心（6 000 r/min，5 min），菌體用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2）沖洗后再次離心（6 000 r/min，5 min），重復(fù)沖洗步驟3次，獲得的菌體用于降解能力測(cè)定。將獲得的菌體接種至10 mL新鮮的MSM培養(yǎng)基中，并添加對(duì)硝基苯酚至終濃度100 mg/L，作為處理組；以相同條件下的MSM并添加對(duì)硝基苯酚至相同濃度，但不添加菌液，作為對(duì)照組。將獲得的培養(yǎng)液于30℃，180 r/min條件下培養(yǎng)（避光培養(yǎng)），培養(yǎng)5 d后，取培養(yǎng)液檢測(cè)對(duì)硝基苯酚濃度。

根據(jù)測(cè)得處理組與對(duì)照組中對(duì)硝基苯酚的濃度，計(jì)算菌株對(duì)對(duì)硝基苯酚的降解率，計(jì)算公式如下：

其中，Cck指t時(shí)刻對(duì)照組中對(duì)硝基苯酚的濃度，Ct指t時(shí)刻處理組中對(duì)硝基苯酚的濃度。取降解率大于90%培養(yǎng)液進(jìn)行再次劃線培養(yǎng)，重復(fù)上述過程至獲得穩(wěn)定可降解的單菌為止。

1.2.2 對(duì)硝基苯酚降解菌的鑒定 基于形態(tài)學(xué)與生理生化特征分析，結(jié)合16S rRNA基因分析對(duì)獲得的對(duì)硝基苯酚降解菌進(jìn)行鑒定。將獲得的降解菌劃線接種至LB固體培養(yǎng)基上，于30℃恒溫培養(yǎng)24 h后用于菌落形態(tài)觀察，并參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)菌株進(jìn)行生理生化特征分析［11]。

使用細(xì)菌基因組小提試劑盒（TaKaRa）提取目標(biāo)菌株的基因組并用于16S rRNA基因擴(kuò)增，所使用的16S rRNA基因擴(kuò)增通用引物27F和1492 R引物序列如表1所示，PCR反應(yīng)條件如表2所示。使用切膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，將回收產(chǎn)物連接至pMD19-T載體后轉(zhuǎn)入E. coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，并通過藍(lán)白斑篩選陽性克??；對(duì)獲得的陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒提?。ㄙ|(zhì)粒小提試劑盒），提取后的質(zhì)粒送英濰捷基進(jìn)行測(cè)序；測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，使用MEGA 7.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，采用NJ法進(jìn)行發(fā)育樹的構(gòu)建（Bootstrap值為1 000）［12]。

表1 基因名稱與引物序列

表2 各基因PCR反應(yīng)條件

1.2.3 溫度、初始pH及鹽度對(duì)降解率的影響 為探索環(huán)境因素對(duì)降解率的影響，選擇了典型的溫度、pH及鹽度作為研究對(duì)象進(jìn)行探索，具體條件設(shè)置，見表3。將獲得的降解菌在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600=0.8后取1 mL菌液進(jìn)行離心收集菌體（菌體離心與洗滌辦法參考1.2.1進(jìn)行）。所有對(duì)照組與處理均12 h取樣一次進(jìn)行對(duì)硝基苯酚濃度測(cè)定，且所有處理組與對(duì)照組均設(shè)3次重復(fù)，并根據(jù)測(cè)得對(duì)硝基苯酚濃度計(jì)算菌株對(duì)對(duì)硝基苯酚的降解率。

表3 溫度、初始pH及鹽度對(duì)降解率影響分析的條件設(shè)置

1.2.4 菌株降解對(duì)硝基苯酚的代謝產(chǎn)物檢測(cè)與代謝途徑分析 將獲得的降解菌接種至含100 mg/L對(duì)硝基苯酚的MSM液體培養(yǎng)基（pH 7.0）中，在30℃，180 r/min條件下避光培養(yǎng)，每12 h取樣一次進(jìn)行代謝產(chǎn)物提取與檢測(cè)。代謝產(chǎn)物的提取參考Samanta的方法［13]，具體如下：將獲得的培養(yǎng)液進(jìn)行離心收集上清并加入等體積的乙酸乙酯充分震蕩混勻后移取有機(jī)相（中性提?。?，再向剩余的水相中加入鹽酸調(diào)整pH至2.0后再加入等體積的乙酸乙酯充分震蕩混勻后移取有機(jī)相（酸性提?。?，最終將中性提取和酸性提取的有機(jī)相混合。通過氮吹儀將混合后的有機(jī)相吹干，將獲得的沉淀用1 mL的甲醇復(fù)溶后用0.22 μm的有機(jī)相濾膜過后用于代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜分析。采用LC-MS進(jìn)行代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜檢測(cè)，具體條件如下：島津LC-MS（8040），流動(dòng)相為甲醇（100%），流速0.2 mL/min，采用直接進(jìn)樣（進(jìn)樣量1μL），在負(fù)離子模式下檢測(cè)，毛細(xì)管電壓為3.5 kV，載氣為氮?dú)猓?9.9%），掃描范圍為100-600 m/z，使用Realtime Analysis對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行采集和分析。

1.2.5 對(duì)硝基苯酚降解相關(guān)基因的克隆 根據(jù)已報(bào)道的對(duì)硝基苯酚降解相關(guān)基因設(shè)計(jì)引物，引物名稱與序列信息見表1，以獲得的降解菌基因組為模板進(jìn)PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件見表2。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，對(duì)獲得的條帶進(jìn)行切膠回收，連接至pMD19-T載體并轉(zhuǎn)入E. coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，并通過藍(lán)白斑篩選陽性克??；對(duì)獲得的陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒提?。ㄙ|(zhì)粒小提試劑盒，TaKaRa），提取后的質(zhì)粒送英濰捷基進(jìn)行測(cè)序；測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST分析并與已有報(bào)道的對(duì)硝基苯酚降解目的基因進(jìn)行比對(duì)與分析。

1.2.6 對(duì)硝基苯酚檢測(cè)方法的建立 基于高效液相色譜法（HPLC）對(duì)樣品中硝基苯酚的濃度進(jìn)行測(cè)定。首先，建立對(duì)硝基苯酚的HPLC的檢測(cè)方法，具體如下：高效液相色譜儀為安捷倫1260（Agilent，USA），色譜柱為Eclipse Plus C18（4.6×75 mm，3.5 μm），流動(dòng)相為甲醇、乙腈和水的混合物（80∶10∶10），流速3 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量20 μL，檢測(cè)器為可變波長(zhǎng)檢測(cè)器（VWD），檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm。通過配制標(biāo)準(zhǔn)濃度的對(duì)硝基苯酚溶液，并建立與320 nm處吸收值關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線（R2均大于0.99）。對(duì)硝基苯酚的HPLC檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。所有樣品均需經(jīng)孔徑為0.2 μm的濾膜過濾后，再經(jīng)HPLC檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)硝基苯酚降解菌的分離與鑒定

經(jīng)多次富集與篩選，分離獲得一株可高效降解對(duì)硝基苯酚的菌株，命名為RL-JY1，該菌株可以對(duì)硝基苯酚為唯一碳源，在72 h內(nèi)對(duì)100 mg/L對(duì)硝基苯酚的降解率為100%。該菌在LB平板上呈乳白色，圓形，表面光滑濕潤，菌落邊緣光滑（圖2），菌株的生理生化特征如表4所示。

經(jīng)PCR擴(kuò)增、連接、轉(zhuǎn)化及測(cè)序后，獲得了一段長(zhǎng)度為1 495 bp的16S rRNA基因的部分序列，序列信息已遞交至GenBank（登錄號(hào)為：MK101056），通過 BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）與已報(bào)道的序列進(jìn)行比對(duì)，初步判斷菌株RL-JY1為假單胞菌屬（Pseudomonassp.）細(xì)菌。根據(jù)BLAST的初步比對(duì)結(jié)果，從LPSN（List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature，http：//www.bacterio.net/index.html）數(shù)據(jù)庫下載相關(guān)菌屬細(xì)菌16S rRNA基因序列，用于系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，16S rRNA基因序列分析結(jié)果（圖3）顯示菌株RL-JY1與惡臭假單胞菌（P.putida）親緣關(guān)系較近。根據(jù)16S rRNA基因序列分析結(jié)合生理生化特征分析，確定菌株RLJY1為惡臭假單胞菌。

圖1 對(duì)硝基苯酚的HPLC檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 菌株RL-JY1在LB平板上的菌落形態(tài)

表4 菌株RL-JY1的生理生化特征

2.2 溫度、初始pH及鹽度對(duì)菌株RL-JY1降解對(duì)硝基苯酚的影響

溫度對(duì)菌株RL-JY1降解對(duì)硝基苯酚的影響如圖4-A所示，可以看出菌株RL-JY1具有較寬的溫度耐受范圍，在20-40℃間，對(duì)100 mg/L對(duì)硝基苯酚的72 h降解率均大于95%（20℃時(shí)為96.3%，30℃與40℃均為100%）；當(dāng)溫度為10℃或50℃時(shí)菌株對(duì)對(duì)硝基苯酚的降解受到顯著抑制（47.3%，10℃；68.5%，50℃）。不同初始pH對(duì)菌株RL-JY1降解對(duì)硝基苯酚的影響如圖4-B所示，菌株RL-JY1在pH 5-7范圍內(nèi)，隨著pH值的升高，菌株對(duì)對(duì)硝基苯酚的降解率（72 h，100 mg/L）逐漸升高，當(dāng)pH為7.0時(shí)，72 h內(nèi)對(duì)100 mg/L對(duì)硝基苯酚降解率為100%；當(dāng)pH值超過7.0以后，隨著pH值的上升菌株對(duì)對(duì)硝基苯酚的降解率逐漸下降，當(dāng)pH值為10.0時(shí)，72 h對(duì)100 mg/L對(duì)硝基苯酚的降解率為52.7%；值得注意的是，在pH 5.0、6.0、8.0和9.0條件下，菌株72 h對(duì)對(duì)硝基苯酚（100 mg/L）的降解率均大于60%（pH為5.0時(shí)降解率為46.2%，pH為6.0時(shí)降解率為63.7%，pH為8.0時(shí)降解率為96.2%，pH為9.0時(shí)降解率為72.3%），由此可判斷菌株RL-JY1對(duì)pH有較寬的耐受范圍，并對(duì)酸性條件具有較好的耐受能力。鹽度對(duì)菌株RL-JY1降解對(duì)硝基苯酚的影響如圖4-C所示，在NaCl濃度為0-8%范圍內(nèi)，對(duì)硝基苯酚的降解率無明顯變化，當(dāng)NaCl濃度超過8%后，隨著NaCl濃度升高，降解率逐漸下降（NaCl濃度達(dá)為10%時(shí)，降解率為71.4%；NaCl濃度達(dá)為12%時(shí)，降解率為43.6%）。

圖3 菌株RL-JY1的16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析

2.3 菌株RL-JY1降解對(duì)硝基苯酚的代謝產(chǎn)物及代謝途徑分析

通過對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析，獲得了菌株RL-JY1降解對(duì)硝基苯酚的代謝產(chǎn)物信息（圖5-A）；結(jié)合已有對(duì)硝基苯酚降解相關(guān)報(bào)道，推測(cè)質(zhì)譜檢測(cè)獲得的對(duì)硝基苯酚降解產(chǎn)物包括4-硝基兒茶酚（m/z=153.8000）、偏苯三酚（m/z=125.1000）和馬來酰乙酸（m/z=157.1000），進(jìn)一步提出菌株RL-JY1降解對(duì)硝基苯酚的代謝途徑如圖5-B所示，即典型的偏苯三酚途徑。

圖4 環(huán)境因素對(duì)菌株RL-JY1降解對(duì)硝基苯酚的影響

圖5 菌株RL-JY1降解對(duì)硝基苯酚代謝中間產(chǎn)物檢測(cè)與代謝途徑分析

2.4 對(duì)硝基苯酚降解相關(guān)基因的克隆

以提取的菌株RL-JY1基因組為模板，通過設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示。其中，pnpABC基因的PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果為陽性，且條帶大小與目標(biāo)片段大小一致。對(duì)目標(biāo)條帶進(jìn)行切膠回收、連接、轉(zhuǎn)化并送測(cè)序。對(duì)測(cè)序片段進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，并與已有報(bào)道的pnpABC基因序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，來自于菌株RL-JY1中的pnpA、pnpB和pnpC基因與惡臭假單胞菌DLL-E4的pnpA、pnpB和pnpC基因的序列一致性分別為99%、98%和100%，翻譯后的氨基酸序列相似性均為100%。同時(shí)，基于獲得的菌株RL-JY1對(duì)對(duì)硝基苯酚的代謝途徑，結(jié)合已有報(bào)道，確定了獲得的參與對(duì)硝基苯酚降解的相關(guān)基因的特定功能（圖5-B）。

圖6 對(duì)硝基苯酚降解相關(guān)基因pnpABC的電泳檢測(cè)

3 討論

對(duì)硝基苯酚作為硝基酚類化合物中的典型代表，伴隨其大量使用，其在環(huán)境中被廣泛檢出，同時(shí)，其對(duì)人體健康及環(huán)境安全的影響也得到了廣泛和深入的研究。探尋高效、安全且經(jīng)濟(jì)的環(huán)境污染治理方法，是廣大科研工作者孜孜以求的目標(biāo)。針對(duì)對(duì)硝基苯酚的生物降解，目前已有較多的降解菌被分離報(bào)道，代謝途徑（主要包括通過偏苯三酚和鄰苯二酚介導(dǎo)的開環(huán)代謝途徑）及相關(guān)分子機(jī)制（典型的如pnp基因簇與npd基因簇）也已得到了一定程度的研究［14-17]。但需要指出的是，具有良好環(huán)境適應(yīng)性、惡劣條件耐受能力菌株的降解菌報(bào)道仍然較少。因此，分離獲得具有良好環(huán)境適應(yīng)性的降解菌，為環(huán)境修復(fù)及工業(yè)廢水處理提供新的降解菌資源具有重要意義。同時(shí)，對(duì)于菌株降解對(duì)硝基苯酚代謝途徑與相關(guān)分子機(jī)制的闡明，為菌株的改造與工程化應(yīng)用提供了理論參考。

本研究從長(zhǎng)期受城市廢水污染的近海灘涂的海水與淤泥樣品中，經(jīng)過多次富集、馴化，分離獲得一株可高效降解對(duì)硝基苯酚的細(xì)菌RL-JY1，經(jīng)菌落形態(tài)、生理生化特征及16S rRNA基因分析，確定該菌為惡臭假單胞菌。目前，已報(bào)道的可降解對(duì)硝基苯酚的細(xì)菌種屬包括紅球菌屬（Rhodococcussp.）［18]、勞爾氏菌屬（Ralstoniasp.）［19]、無色桿菌屬（Achromobactersp.）［20]、節(jié)桿菌屬（Arthrobactersp.）［21]、假單胞菌屬［22]、莫拉克斯氏菌屬（Moraxellasp.）［23]、芽孢桿菌屬（Bacillussp.）［24]等，其中節(jié)桿菌屬和假單胞菌屬分別是革蘭氏陽性與革蘭氏陰性細(xì)菌的典型代表。

在環(huán)境適應(yīng)性方面，菌株RL-JY1對(duì)環(huán)境溫度與pH具有良好的耐受能力，對(duì)溫度與pH都具有較寬的耐受范圍。在相對(duì)較高溫度（50℃）時(shí)，菌株RL-JY1對(duì)對(duì)硝基苯酚仍具有較強(qiáng)降解能力（68.5%），這可能是由于菌株RL-JY1分離自常年氣溫較高的雷州半島（中國大陸最南端），長(zhǎng)期的環(huán)境馴化使得菌株對(duì)于環(huán)境溫度表現(xiàn)出較好的耐受能力；菌株對(duì)于環(huán)境pH較寬的耐受范圍對(duì)于菌株RL-JY1在環(huán)境污染修復(fù)及工業(yè)廢水處理中的應(yīng)用具有重要意義；同時(shí)，菌株RL-JY1表現(xiàn)出對(duì)鹽度良好的適應(yīng)性，在一定程度是由于樣品采自沿海灘涂（沿海灘涂由于水分的蒸發(fā)，而鹽分留在土壤中，鹽度在不同時(shí)間略有變化）。目前，不論是環(huán)境污染修復(fù)還是工業(yè)廢水處理，都面臨著相同的問題，即環(huán)境因素復(fù)雜且處理?xiàng)l件惡劣，如環(huán)境溫度變化較大、工業(yè)廢水處理?xiàng)l件復(fù)雜（污染物濃度較高、高鹽及極端pH）等。環(huán)境適應(yīng)性分析的結(jié)果表明，菌株RL-JY1具有良好的環(huán)境適應(yīng)能力與應(yīng)用前景。

已有關(guān)于對(duì)硝基苯酚降解途徑與相關(guān)分子機(jī)制的報(bào)道中，對(duì)節(jié)桿菌屬與假單胞菌屬的研究較為深入，也分別是革蘭氏陽性與革蘭氏陰性細(xì)菌的典型代表，且代謝途徑與相關(guān)基因也可以革蘭氏陽性與革蘭氏陰性細(xì)菌為區(qū)分歸類討論。已報(bào)道的對(duì)硝基苯酚的降解途徑主要有兩類：（1）通過對(duì)苯二醌將對(duì)硝基苯酚轉(zhuǎn)化為對(duì)苯二酚并進(jìn)一步被開環(huán)利用，因此也被稱作對(duì)苯二酚代謝途徑（Hydroquinone，HQ），這種代謝途徑在革蘭氏陰性細(xì)菌中報(bào)道較多［25]；（2）通過4-硝基兒茶酚將對(duì)硝基苯酚轉(zhuǎn)化為偏苯三酚并進(jìn)一步開環(huán)利用，因此也稱作偏苯三酚代謝途徑（1，2，4-Benzenetriol，BT），這種代謝途徑在革蘭氏陽性細(xì)菌與陰性細(xì)菌中均有報(bào)道［16，26]。而對(duì)應(yīng)的參與對(duì)硝基苯酚降解的相關(guān)基因也非常保守，革蘭氏陽性細(xì)菌中以節(jié)桿菌為代表，由雙組分的氧化還原酶將對(duì)硝基苯酚轉(zhuǎn)化為偏苯三酚，偏苯三酚再由偏苯三酚雙加氧酶開環(huán)生成馬來酰乙酸，相關(guān)基因簇已經(jīng)得到較深入的研究；同時(shí)，值得注意的是已報(bào)道的節(jié)桿菌屬細(xì)菌除了可以降解對(duì)硝基苯酚，還可降解其他對(duì)位取代酚，如對(duì)氯苯酚和對(duì)氟苯酚［27-28]。而在革蘭氏陰性細(xì)菌中，以假單胞菌屬為代表，可以同時(shí)通過偏苯三酚和對(duì)苯二酚對(duì)對(duì)硝基苯酚進(jìn)行降解，其中的氧化還原酶可將對(duì)硝基苯酚轉(zhuǎn)化為偏苯三酚或?qū)Ρ蕉樱瑢?duì)苯二酚的降解主要是通過對(duì)苯二酚雙加氧酶進(jìn)行開環(huán)，而偏苯三酚則通過偏苯三酚雙加氧酶開環(huán)，同樣，相應(yīng)的基因/基因簇在革蘭氏陰性細(xì)菌中的也較為保守。本研究中獲得的降解菌RL-JY1為具有代表性的惡臭假單胞菌，通過質(zhì)譜分析與基因克隆手段明確了其遺傳背景與代謝途徑相，為具有良好環(huán)境適應(yīng)性與高效降解潛能工程菌的構(gòu)建提供了重要的理論支撐。

4 結(jié)論

從長(zhǎng)期受城市廢水污染的近海灘涂分離獲得了一株對(duì)硝基苯酚降解菌RL-JY1，通過生理生化特征分析與16S rRNA基因分析，確定該菌株為惡臭假單胞菌。菌株RL-JY1對(duì)于環(huán)境溫度、pH及鹽離子濃度都具有良好的適應(yīng)性?；诖x產(chǎn)物分析確定菌株RL-JY1通過偏苯三酚途徑對(duì)對(duì)硝基苯酚進(jìn)行降解。同時(shí)，基于對(duì)已有報(bào)道的對(duì)硝基苯酚降解相關(guān)基因設(shè)計(jì)引物，克隆獲得了參與對(duì)硝基苯酚降解上游途徑的相關(guān)基因。本研究從菌株特性、代謝途徑及相關(guān)分子機(jī)制3個(gè)水平系統(tǒng)闡明了菌株RL-JY1對(duì)對(duì)硝基苯酚的降解機(jī)理，結(jié)果表明菌株對(duì)對(duì)硝基苯酚具有高效的降解能力、良好的環(huán)境適應(yīng)性和較好的應(yīng)用潛能。