解淀粉芽孢桿菌淀粉酶催化活力改良及其在枯草芽孢桿菌中的高效表達

邱錦 黃火清 姚斌 羅會穎

（中國農業(yè)科學院飼料研究所，北京 100081）

淀粉是大量存在于自然界中的植物多糖［1]，是以葡萄糖為單體依次連接形成的高度聚合物。根據單糖連接方式不同，分為直鏈淀粉和支鏈淀粉［2-3]。淀粉除了可以被直接食用外，還是工業(yè)生產果葡糖漿、麥芽糖及釀酒等多種工業(yè)的主要原料［4]，其在被利用過程中必須被水解為低聚糖或單糖［5]。α-淀粉酶是一類作用于淀粉內部水解其α-1，4糖苷鍵從而將淀粉水解為糊精、低聚糖和單糖的酶［6]。α-淀粉酶是工業(yè)上應用最早、用途最廣及產量最大的酶制劑產品之一?？蓮V泛應用于食品、動物飼料、洗滌劑、生物燃料、生物制藥等多種工業(yè)生產過程中［8]。烘焙行業(yè)中，添加適量的淀粉酶可以增加面包的蓬松度，改善口感［9]；在啤酒釀造工業(yè)中，添加淀粉酶可以增加麥芽的降解率，提高利用率［10]；在洗滌劑行業(yè)中，淀粉酶可以有效降解淀粉類污漬［11]。α-淀粉酶可以從植物，動物和微生物中獲得，同時淀粉酶的表達，純化，發(fā)酵等技術也日益成熟。其中，微生物來源的α-淀粉酶由于其穩(wěn)定性和經濟可行性而被普遍應用［12]。

微生物來源的淀粉酶在生產應用中變得愈加重要，與動植物來源淀粉酶相比，真菌和細菌淀粉酶具有成本效益高、一致性好、生產所需時間和空間少、易于工藝修改和優(yōu)化等優(yōu)點［12]。尤其是芽孢桿菌來源的淀粉酶，已經受到全世界研究人員的廣泛關注，并對其進行了深入的研究。與其他微生物相比，芽孢桿菌是表達淀粉酶的優(yōu)勢菌株，表達量和酶活均相對較高。同時，由于芽孢桿菌自身的分泌表達系統(tǒng)，使得所產生的淀粉酶直接分泌到細胞外，無需細胞破碎等過程，酶學性質檢測及純化步驟簡單。目前，對芽孢桿菌來源的淀粉酶研究涉及熱穩(wěn)定性、水解活力及三維結構等多個方面。其中，耐熱淀粉酶多來自于地衣芽孢桿菌［13]。此外，多個芽孢桿菌來源的淀粉酶晶體結構也已經被報道［14-16]。通過對結構的研究得出，大多數芽孢桿菌來源的淀粉酶屬于糖苷水解酶13家族，同時具有Ca2+結合位點。同時對于這種來源淀粉酶也進行了許多突變研究，酶學性質顯著提高，并可以應用到生產實踐中。已有報道顯示通過定向進化使淀粉酶在堿性條件下酶活提高5倍［17]，通過理性設計使解淀粉芽孢桿菌淀粉酶的最適溫度由83℃提高到106℃［18]。同時挖掘Ca2+非依賴型淀粉酶基因，以使在生產過程中降低成本［19]。

按照糖苷水解酶（Carbohydrate-active enzymes，CAZy））數據庫（http：//www.cazy.org/）的分類，α-淀粉酶主要屬于糖苷水解酶第13家族（GH13）［20]。另有少部分屬于GH57、GH119 或者 GH126家族［21-23]。目前已經有多個GH13家族的淀粉酶結構被報道［15-17]。GH13家族淀粉酶由 A（（β/α）8八桶狀結構）、B、C（β-三明治結構）3個結構域組成。A結構域是催化結構域，天冬氨酸、谷氨酸及天冬氨酸構成了催化活性中心。B結構域的Loop區(qū)對淀粉酶的熱穩(wěn)定性起到重要作用［24]。C結構域呈現(xiàn)β片層結構，有報道指出它類似酶的底物結合域（Carbohydrate-binding module，CBM），對底物的結合起到重要作用［25]。因此對C結構域進行理性設計可能提高酶與底物的結合能力，從而提高水解活力。

具有高催化活力的淀粉酶由于其水解效率高，生產成本低，一直受到廣泛的青睞。目前已經報道的淀粉酶生產菌株的產酶能力雖然能滿足工業(yè)生產需求，但仍有較大的提升空間。因此，如何利用生物技術手段，改造現(xiàn)有的淀粉酶，提高水解效率，進一步降低生產成本依然是目前亟待解決的問題。本研究中，以目前廣泛應用的來源于解淀粉芽孢桿菌的中溫中性淀粉酶BAMYA為出發(fā)蛋白，通過理性設計在該淀粉酶的C端結構域設計突變位點，利用定點突變得到了比活及催化效率均大幅度提高的突變體BAMYA-L473K/K474H/N475K，并在枯草芽孢桿菌中實現(xiàn)高效表達。該突變體應用于工業(yè)生產可有效提高其水解效率，降低應用成本，有著非常廣闊的應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒 基因克隆宿主菌株大腸桿菌（Escherichia coli）Trans-T1、 感 受 態(tài) 細 胞 DMT購自北京全式金公司，表達宿主菌株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）SCK6及質粒pHYP16由本實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB 液體培養(yǎng)基（g/L）：酵母浸提物5，胰蛋白胨 10，NaCl 10。LB 固體培養(yǎng)基（g/L）：酵母浸提物 5，胰蛋白胨 10，NaCl 10，瓊脂粉 15。發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：酵母浸提物 20，蛋白胨 40，豆粕30，玉米粉 38，NaH2PO42。

1.1.3 試劑及儀器 直鏈淀粉購自 Sigma 公司；質粒提取試劑盒及 DNA膠回收試劑盒購自 OMEGA 公司；FastPfu DNA聚合酶、快速突變試劑盒（Fast Mutagenesis System）、甲基化質粒模板消化酶購自北京全式金公司，BeaverBead His-tag Protein Purification磁珠（組氨酸標簽蛋白純化瓊脂糖磁珠）購自蘇州海貍生物科技有限公司，是專為高效、快速純化組氨酸標簽蛋白而設計的一種新型功能化材料，可通過磁性分離方式直接從生物樣品中一步純化出高純度的目標蛋白。其他試劑均為國產分析純。

T100 Thermal Cycler PCR與電轉儀、DYY-6C凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad），BioTek酶標儀（美國Thermo），HiTrap Q XL陰離子柱（美國GE）。

1.2 方法

1.2.1 穿梭質粒pHYP16-Amp-Bamy的構建 本研究所用的質粒，是在芽孢桿菌表達載體 pHYP16的基礎之上，利用同源重組的方法，加入大腸桿菌的復制原件以及氨芐抗性基因，得到穿梭型載體pHYP16-Amp，其能同時在大腸桿菌以及枯草芽孢桿菌中操作。來源于解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）的淀粉酶基因Bamy是由公司合成，采用POE-PCR（Prolonged overlap extension PCR）［26]的方法，在載體上插入Bamy，得到pHYP16-Amp-Bamy。

POE-PCR程序如下：（1）擴增目的基因Bamy：反 應 體 系 50 μL ：10×buffer 5 μL，dNTP 5 μL，硫酸鎂 2 μL，pUC57-Bamy模板 1 μL，引物Bamy-F 1 μL，引物Bamy-R 1 μL，F(xiàn)astPfu DNA 聚合酶 1 μL，ddH2O 34 μL。PCR 條 件 為 ：95℃反應 5 min，一個循環(huán)；95℃反應30 s，60℃反應30 s，72℃反應1 min 30 s，以上3個步驟重復32個循環(huán)；72℃反應10 min，一個循環(huán)。反應產物取出后于4℃保存。（2）擴增載體pHYP16：反應體系50 μL：10×buffer 5 μL，dNTP 5 μL，硫酸鎂 2 μL，pHYP16 模板 1 μL，引物 pHYP16-F 1 μL，引物 pHYP16-R 1 μL，F(xiàn)astPfu DNA 聚 合 酶 1 μL，ddH2O 34 μL。PCR 條 件 為 ：95℃反應5 min，一個循環(huán)；95℃反應30 s，60℃反應30 s，72℃反應3 min 30 s，以上3個步驟重復32個循環(huán)；72℃反應10 min，一個循環(huán)。反應產物取出后于4℃保存。

將以上兩步得到的PCR產物進行膠回收，回收后進行片段和載體搭建，體系如下：10× buffer 5 μL，dNTP 5 μL，硫酸鎂 2 μL，pHYP16 回收片段7 μL，Bamy回收片段3 μL。FastPfu DNA 聚合酶 1 μL，ddH2O 27 μL。PCR 條 件 為 ：95℃反應 5 min，一個循環(huán)；95℃反應30 s，60℃反應30 s，72℃反應5 min，以上3個步驟重復30個循環(huán)；72℃反應10 min，一個循環(huán)。反應產物取出后于4℃保存。

PCR過程中所用引物序列，見表1。

表1 野生型質粒及突變體構建所用引物

將得到的PCR產物轉化大腸桿菌Trans1-T1，涂氨芐固體LB平板，37℃恒溫過夜培養(yǎng)，長出菌落后進行菌落PCR驗證，所用引物為Bamy-F/R。根據核酸電泳檢測結果，送條帶正確的克隆子進行測序。得到穿梭型質粒pHYP16-Amp-Bamy。

1.2.2 序列分析突變體設計 來源于嗜堿芽孢桿菌KSM-1378的高比活、中溫淀粉酶LAMY的比活比工業(yè)上廣泛應用的、地衣芽孢桿菌來源的嗜熱淀粉酶的比活高10倍［27]。將淀粉酶BAMYA與LAMY進行序列比對與結構比對（圖1和圖2），尋找有差異的位點。同時由于針對的是水解活力方面的改造，我們將突變位點主要集中在與底物結合有關的C結構域（C端），將有差異的位點進行突變，設計突變體BAMYA-L473K/K474H/N475K。

圖1 BAMYA與LAMY的序列比對結果

圖2 BAMYA（綠色）與LAMY（青色）三維結構對比圖

1.2.3 載體pHYP16-BAMYA-L473K/K474H/N475K構建 利用全式金快速突變試劑盒（Fast mutagenesis system）按照操作說明進行突變。PCR體系為：2×TransStart FastPfu Fly PCR SuperMix 25 μL，突變正向引物BamyA-F 1 μL，突變反向引物BamyA-R 1 μL，模板 pHYP16-Bamy質粒 10 ng 1 μL，ddH2O 22 μL。PCR 條 件 為 ：94℃反應 2 min，一個循環(huán) ；94℃反應20 s，55℃反應20 s，72℃反應4 min，以上3個步驟重復25個循環(huán)；72℃反應10 min，一個循環(huán)。反應產物取出后于4℃保存。引物序列見表1。

PCR產物中加入1 μL DMT消化酶，在37℃水浴鍋中反應1 h，取出后，10 μL產物轉化大腸桿菌50 μL DMT感受態(tài)細胞中，菌液涂布于氨芐抗性平板，37℃過夜培養(yǎng)，待長出菌落后，進行菌落PCR驗證，目的基因為1.5 kb，經核酸電泳檢測后，選擇條帶大小正確的轉化子測序。

1.2.4 重組酶BAMYA及突變體BAMYA-L473K/K474H/N475K在芽孢桿菌中的表達及純化 將序列正確的野生型及突變體質粒轉化入枯草芽孢桿菌SCK6中，涂布于含有1.5% 可溶性淀粉的四環(huán)素抗性平板，于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。由于芽孢桿菌為分泌型表達宿主，成功表達的轉化子會在平板上顯示淀粉水解圈，在長出的轉化子中選擇菌體小、水解圈大的克隆，挑至50 mL LB培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min，過夜培養(yǎng)，即得到種子液。將種子液以4%接種量轉接至500 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min，培養(yǎng)3 d。對所得到的發(fā)酵菌液離心后，收集上清，測定淀粉酶活力。

發(fā)酵上清濃縮10倍，濃縮用1 L去離子水清洗膜包，用1 L的0.5 mol/L NaOH清洗膜包中雜蛋白，最后用1 L去離子水清洗殘留的NaOH，然后對發(fā)酵上清進行濃縮。在pH 7.4，20 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液中4℃過夜透析，透析后進行磁珠親和層析。親和層析的純化步驟為：配置平衡 液 Binding buffer為 pH 7.4，20 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4，洗脫液為含有不同濃度咪唑（20 mmol/L、50 mmol/L、80 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L、500 mmol/L） 的 pH 7.4，20 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4。吸取海貍磁珠（是專為高效、快速純化組氨酸標簽蛋白而設計的一種新型功能化材料，可通過磁性分離方式直接從生物樣品中一步純化出高純度的目標蛋白）20 mL與磁力架上靜置30 s，棄掉廢液，依次用去離子水以及Binding buffer平衡磁珠，使其處于可以結合目標蛋白質的離子條件下。向平衡好的磁珠中加入50 mL上述透析好的淀粉酶液，漩渦混合2 h。取下后依次用含有20 mmol/L，50 mmol/L、80 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L及500 mmol/L的洗脫液進行目的蛋白的洗脫，并收集所有洗脫液。進行后續(xù)SDSPAGE蛋白電泳檢測。對含有目的蛋白的收集液，在pH 8.0，20 mmol/L Tris-HCl緩沖液中進行過夜透析，透析后進行陰離子柱純化，所用平衡緩沖液為pH 8.0，20 mmol/L Tris-HCl，洗脫液為在平衡液的基礎上加入1 mol/L NaCl。純化后進行峰收集，測定酶活力，并利用SDS-PAGE進行蛋白電泳檢測。純化后得到的酶液用于酶學性質分析。

1.2.5 α-淀粉酶的酶活測定 α-淀粉酶的酶活測定方法采用 DNS（3，5-二硝基水楊酸）定糖法［28]。將按 GB/T24401-2009 方法配制的 2% 可溶性淀粉用相應 pH 緩沖溶液稀釋至 1% 終濃度淀粉溶液作為底物，測量體系包括 900 μL的底物和 100 μL 適當稀釋的酶液，在 55℃ 水浴鍋中反應 20 min，加入 1.5 mL的 DNS 試劑終止反應后，置于沸水浴中處理 5 min，快速冷卻至室溫后取250 μL混合液用酶標儀讀取在波長540 nm下的吸光值，每組反應設置1個空白對照及3個平行（突變體的酶活力測定方法相同，溫度采用60℃）。

酶活單位（U）定義：在最適條件下，每分鐘水解可溶性淀粉生成 1 μmoL 葡萄糖所需的酶量為一個酶活單位。

1.2.6 重組酶BAMYA及突變體BAMYA-L473K/K474H/N475K酶學性質的研究

1.2.6.1 最適pH和pH穩(wěn)定性的測定 純化后的野生型淀粉酶 BAMYA及突變體BAMYA-L473K/K474H/N475K在最適溫度條件下（BAMYA為55℃，突變體為60℃），與不同 pH（pH 3.0-8.0，20 mmol/L 檸檬酸-磷酸鹽緩沖液）的底物進行酶促反應，以測定其最適 pH。將 BAMYA及突變體在不同 pH 值（pH 3.0-8.0）的 20 mmol/L 檸檬酸-磷酸鹽緩沖液中置于室溫下處理 1 h，再用 pH 6.0 的緩沖液作適當稀釋，并在最適溫度、pH 6.0 的條件下測定剩余酶活，以未進行處理的樣品酶活為 100% 對照，用于研究重組野生型BAMYA及突變體BAMYA-L473K/K474H/N475K的pH 穩(wěn)定性。每個反應3個平行及一個空白對照，根據測定結果繪制最適pH及pH穩(wěn)定性曲線。

1.2.6.2 最適溫度與溫度穩(wěn)定性的測定 用pH 6.0的緩沖液將純化后的BAMYA及突變體BAMYAL473K/K474H/N475K稀釋后，在不同溫度下（60-80℃）進行酶促反應以確定其最適溫度。將純化后的BAMYA及突變體分別在60、70和80℃ 下保溫，2 min、5 min、10 min、30 min及60 min取樣后迅速置于冰上5 min，并在最適溫度、pH 6.0 的條件下測定剩余酶活性，以未熱處理的酶活為 100% 對照，以研究野生型BAMYA及突變體的熱穩(wěn)定性。每個反應3個平行及一個空白對照，根據測定結果繪制最適溫度及熱穩(wěn)定性曲線。

1.2.6.3 比活及動力學參數測定 對所有需要測定酶學性質的蛋白進行定量，按照TransGene蛋白定量試劑盒的說明書進行，如表2所示。將BSA按照表中所示濃度進行配置后，吸取20 μL BSA標準品及待定量的樣品，與200 μL考馬斯亮藍顯色液混合，室溫放置10 min，在OD595nm下讀取吸光值，根據吸光值和蛋白濃度繪制標準曲線，擬合出蛋白含量與吸光度的線性關系。比活力單位定義為，每毫克酶蛋白所具有的酶活力單位數。

分別配制最適 pH 下不同濃度的底物（0.5-10.0 mg/mL），酶反應體系組成不變，但是酶反應時間10 min。在最適條件下測定酶活力，利用 GraphPad Prism［29]軟件分析得到BAMYA及突變體以可溶性淀粉為底物時的Vmax和Km值。

表2 蛋白含量標準曲線的繪制

2 結果

2.1 穿梭質粒pHYP16-Amp-Bamy的構建

本研究所用基因是芽孢桿菌來源的，并且芽孢桿菌對于淀粉酶的表達量較高，因此我們選擇枯草芽孢桿菌作為表達宿主。此外，本研究涉及大量的定點突變工作，相對于芽孢桿菌而言，大腸桿菌感受態(tài)的轉化效率高，因此，定點突變在大腸桿菌中進行，獲得突變后在芽孢桿菌中進行表達。本實驗所用質粒需要滿足可以同時在大腸桿菌以及芽孢桿菌中操作的條件。利用同源重組的方法，在芽孢桿菌表達載體pHYP16中插入了大腸桿菌復制原件以及氨芐抗性基因，得到穿梭型載體pHYP16-Amp。構建好的質粒及過成如圖3所示。

圖3 枯草芽孢桿菌-大腸桿菌穿梭型質粒的構建（A）插入淀粉酶基因Bamy、氨芐抗性基因及其啟動子前（B）插入淀粉酶基因Bamy、氨芐抗性基因及其啟動子后

2.2 序列分析和突變體的構建

將突變位點集中在與底物結合有關的C結構域，分析并突變后，對突變體基因進行測序，得到組合突變體BAMYA-L473K/K474H/N475K。

2.3 α-淀粉酶BAMYA及BAMYA-L473K/K474H/N475K在枯草芽孢桿菌中的表達及純化

對突變后的轉化子進行測序后，利用Vector 10.0軟件進行突變前后氨基酸及核酸序列比對，比對結果證明成功得到了突變體BAMYA-L473K/K474H/N475K，將構建的重組質粒pHYP16-BAMYA及其突變體在枯草芽孢桿菌SCK6中成功地實現(xiàn)異源表達，從含有可溶性淀粉的固體瓊脂平板中得到水解圈大的克隆子，進行小瓶培養(yǎng)，而后轉接發(fā)酵培養(yǎng)基進行搖瓶培養(yǎng)。離心收集發(fā)酵液上清，測定淀粉酶活力約為760 U/mL和1 260 U/mL。將得到的粗酶液用 10 kD 膜包過濾濃縮以初步除去酶液中的鹽分及其他小分子物質，進一步用磁珠進行純化及陰離子交換層析，進行蛋白純化，經 SDS-PAGE 蛋白電泳檢測，得到電泳純酶蛋白（圖 4）。分子量約為55 kD，與理論計算分子量一致。

圖4 淀粉酶野生型以及突變體純化后SDS-PAGE分析

2.4 重組酶BAMYA及突變體酶學性質測定

野生型淀粉酶BAMYA最適pH為6.0，最適溫度為55℃。突變體最適pH 6.0，最適溫度為60℃，與野生型相比最適溫度提高了5℃。BAMYA和突變體的pH穩(wěn)定性表現(xiàn)為：在pH 6.0均剩余40%左右酶活，pH 7.0-11.0穩(wěn)定，pH 12.0剩余50% 左右的酶活，在低于pH 5.0的條件下幾乎沒有酶活。BAMYA和突變體均具有很好的熱穩(wěn)定性，70℃處理30 min及80℃處理5 min，均剩余90% 以上的酶活。

2.5 比活及動力學常數測定

BAMYA的比活為6 835 U/mg，突變體BAMYAL473K/K474H/N475K比活為10 148 U/mg，比野生型提高48%；野生型的Km值為3.58 mg/mL，突變后BAMYA-L473K/K474H/N475K的Km值為2.21 mg/mL，突變后酶對底物的親和力提高；突變后催化效率由1 577 mL/（s·mg）提高至 4 760 mL/（s·mg），較野生型相比提高了2.01倍（圖 5）。

圖5 野生型BAMYA及突變體BAMYA-L473K/K474H/N475K基本性質

3 討論

中溫淀粉酶廣泛應用于工業(yè)生產中，其最適溫度大多在50-60℃［30]，提高中溫淀粉酶的水解活力及催化效率，以降低生產和使用成本，具有重要的意義。目前，關于淀粉酶水解活力的改造思路有很多，如Lu 等［31]對Bacillus pseudofirmus來源的淀粉酶通過N端截短，將其比活由4.9 U/mg提高到170 U/mg，Km由 11.9 mg/mL降 低 至 3.9 mg/mL；Yang等［32]通過將Alkalimonas amylolytica來源的堿性淀粉酶末端逐一截短并與寡肽融合表達，其比活由9.4 U/mg提高到239 U/mg，Km由26.9 mg/mL降低至15.4 mg/mL；Bessler 等［33]通過定向進化得到解淀粉芽孢桿菌來源淀粉酶BAA水解活力明顯提高的突變體A230V/N297D/K406R/N414S，其比活由15 U/mg提高到140 U/mg。上述結果雖然酶活有一定的提高，但是仍然難以滿足工業(yè)生產要求。本研究利用定點突變，將來源于解淀粉芽孢桿菌，GH13家族的淀粉酶BAMYA進行改良，所得到的淀粉酶突變體的比活達到了10 148 U/mg，并實現(xiàn)在枯草芽孢桿菌中的異源高效表達，突變體BAMYA-L473K/K474H/N475K比活為10 148 U/mg，酶活力達到1 260 U/mL，可以用于實際生產中，大大降低成本。

本研究的突變位點位于近C末端C結構域的473LKN475氨基酸，有文獻曾報道，C端氨基酸組成會影響淀粉酶的pH穩(wěn)定性［34]，但相同位置的突變對比活的影響并未報道過。GH13家族的淀粉酶C結構域呈現(xiàn) β 片層結構，屬于一個未知的底物結合結構域（Carbohydrate binding modules，CBM區(qū)）對于底物的識別和吸附有重要的作用［35]。因此對于該結構域進行理性設計，可能增強其水解活力。還有報道稱，在淀粉酶中還有一些具有特殊功能的結構域，大多數處于N端或者C端，在淀粉酶發(fā)揮水解活力的過程中起到重要作用。例如，來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus）的普魯蘭酶［36]、嗜熱菌屬（Thermussp.）的麥芽淀粉酶［37]等在N端以外還含有類似的催化結構域。另外一些淀粉酶在C結構域之外還含有D、E結構域，與C結構域的功能類似，D結構域使淀粉酶有水解生淀粉的能力，如已經報道的曲霉（Aspergillus kawachii）α-淀粉酶［38]等，同時淀粉酶的C端結構域的芳香族的氨基酸（組氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等）對底物結合起到重要的作用［35]，因此將K474H后，His的咪唑基團更有利于結合糖鏈。另外，參與底物結合的氨基酸的空間構象、以及氨基酸的結構大小也影響著親和力［39]，在本研究中，將BAMYA（WP_013352208.1）的第473位非極性亮氨酸（L）突變?yōu)橘嚢彼幔↘）后，側鏈為底物提供了更好的結合取向。同時有研究表明，帶正電的氨基酸可降低Km，帶負電的氨基酸可提高Km［39]，N475K 突變后可能提高了酶對底物的親和力，從而提高了酶的比活和催化效率。本研究中，我們將BAMYA的C端進行組合突變，突變位點L473K/K474H/N475K有效提高了BAMYA的催化活性，同時該研究為其它淀粉酶突變研究提供理論指導。

根據淀粉酶應用的不同領域，對其性能的要求不盡相同。一些工業(yè)應用中，不可避免有高溫過程，這就要求其酶活高的同時在高溫下具有較好的穩(wěn)定性。盡管有極為少數的解淀粉芽孢桿菌中溫淀粉酶穩(wěn)定性很好，盡管有少數的解中溫淀粉酶穩(wěn)定性很好，如一個Bacillussp. I-3來源的淀粉酶，其最適溫度70℃，在80℃下處理2.5 h后剩余50%酶活，但在最適條件下的表達量僅為642 U/mL［40]；一個Thermobifida fuscaNTU22來源的淀粉酶其最適溫度為60℃，60℃處理3 h仍剩余70%酶活，但比活僅為245 U/mg［41]；本研究中表達的淀粉酶BAMYA及其突變體在高溫下具有很好的穩(wěn)定性，同時水解活力及表達量均較高，突變體BAMYA-L473K/K474H/N475K比活為10 148 U/mg，酶活力達到1 260 U/mL，為淀粉酶生產應用提供了良好的材料。

綜上，本研究通過定點突變獲得一個高水解活力的α-淀粉酶基因，并在枯草芽孢桿菌中成功實現(xiàn)了高效異源表達。突變后得到了一個比活與催化效率明顯提高，同時熱穩(wěn)定性沒有明顯下降的淀粉酶突變體BAMYA-L473K/K474H/N475K。拓寬了淀粉酶在飼料、食品及醫(yī)藥等領域的應用，為生產應用提供了優(yōu)良的材料。通過動力學性質和氨基酸組成兩個角度分析了其比活提高的分子機制，加深了中溫淀粉酶在結構與功能相互關系的認識，也為淀粉酶的發(fā)展開辟了新的道路。

4 結論

本研究構建了芽孢桿菌-大腸桿菌穿梭型質粒，通過理性設計對來源于解淀粉芽孢桿菌淀粉酶基因Bamy進行定點突變。在保持其熱穩(wěn)定性沒有明顯下降的前提下，使其水解活力、催化效率均大幅度提高，比活相較于野生型提高48%。通過分析序列及結構變化，對性質提高的機理進行了解釋，同時該項研究為淀粉酶的生產應用提供了優(yōu)良材料。