蘇云金芽孢桿菌對(duì)PAHs的降解研究

雒曉芳 陳麗華 夏苗苗 許淑娟 熊梅

（1. 西北民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)部，蘭州 730030；2. 西北民族大學(xué)化工學(xué)院，蘭州 730030；3. 西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030）

多 環(huán) 芳 烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是石油、煤、煙草、各種木材，以及有機(jī)高分子化合物等不完全燃燒或在還原條件下經(jīng)熱分解所產(chǎn)生的高毒性、揮發(fā)性化合物，是主要的環(huán)境和食品污染物［1-3]。這些污染物進(jìn)入土壤之后會(huì)經(jīng)歷極其復(fù)雜的化學(xué)變化，長(zhǎng)此以往，將對(duì)土壤的正常結(jié)構(gòu)、生態(tài)平衡造成極大的危害［4-5]。PAHs根據(jù)苯環(huán)數(shù)量可分為低環(huán)和高環(huán)（苯環(huán)≥4）PAHs 兩類，有研究發(fā)現(xiàn)，隨著苯環(huán)數(shù)量的增多，其毒性就越高，生物可利用性越差，越不易被降解［6]。此外，若PAHs存在于環(huán)境中的時(shí)間越長(zhǎng)，其遺傳毒性也會(huì)增強(qiáng)，所以及時(shí)處理環(huán)境中此類污染物尤為重要。

PAHs在自然界中存在著生物水解、光作用裂解、降解等消除方法［7]，使得環(huán)境中的PAHs含量始終保持著一個(gè)動(dòng)態(tài)的平衡［8-9]。然而近幾年來(lái)，人類生產(chǎn)活動(dòng)的加劇，使環(huán)境中的動(dòng)態(tài)平衡遭到很大破壞，環(huán)境中的PAHs大量增加。所以多環(huán)芳烴的降解方法已成為了我們現(xiàn)在研究的熱題。多環(huán)芳烴的去除手段主要有3種：一是直接使用物理措施如加熱揮發(fā)、混凝沉淀法、填埋和吸附等；二是化學(xué)辦法如光氧化、化學(xué)藥劑氧化及臭氧氧化等；三是生物處理法［1]。而對(duì)于多環(huán)芳烴的降解現(xiàn)在采用得最多的則是微生物處理法。微生物處理降解多環(huán)芳烴適用范圍廣、成本低，工業(yè)化程度較高，并且研討較多，現(xiàn)已被很多工廠利用，特別是有機(jī)污染物廢水處理廠。微生物具備較強(qiáng)的分解代謝能力和較高的代謝速率，且微生物品種多樣化，許多細(xì)菌、真菌、藻類如假單胞菌屬（Pseudomonas）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）、諾卡氏菌屬（No-cardia）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、微球菌屬（Micrococcus）等［10-13]都具有降解多環(huán)芳烴的能力。其中在環(huán)境土壤中發(fā)揮主要貢獻(xiàn)的是細(xì)菌［14]。修復(fù) PAHs 污染已成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外環(huán)境科學(xué)界的共同話題和主攻熱點(diǎn)，利用微生物降解PAHs是當(dāng)前控制土PAHs 污染的主要途徑。目前國(guó)際上很多學(xué)者正在致力于多環(huán)芳烴降解菌的篩選工作，可以降解四環(huán)及四環(huán)以上 PAHs的微生物主要有田頭菇屬（Agro-cybe）、芽孢桿菌（Bacillus）、布克氏菌屬（Burkholderia）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、副球菌屬（Paracoccus）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）、寡養(yǎng)食單胞菌（Stenotrophomonas）等［15]。童樂(lè)等［16]利用秸稈做載體固定混合菌劑降解多環(huán)芳烴發(fā)現(xiàn)，其降解率較單純投加菌液或菌液與秸稈簡(jiǎn)單混合有明顯提高。另外，菌體的疏水性是生物修復(fù)中的一個(gè)決定性因素，是影響細(xì)菌吸收和疏水性物質(zhì)降解的重要因素［17]。

蒽（Anthracene）、芘（Pyrene）、芴（Fluorene）、萘（Naphthalene）、菲（Phenanthrene）等是目前研究PAHs 微生物降解機(jī)制的常見(jiàn)環(huán)境污染物的模式化合物［7]。響應(yīng)面法（Response surface methodology，RSM）是在多因素?cái)?shù)量處理實(shí)驗(yàn)的分析中，分析試驗(yàn)指標(biāo)（因變量）與多個(gè)試驗(yàn)因素（自變量）間的回歸關(guān)系，而這種回歸可能是曲線或者曲面的關(guān)系［18-19]。本研究主要是探討蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）在不同溫度、pH、PAHs質(zhì)量條件下對(duì)蒽芘芴這3種化合物的降解特性，并利用響應(yīng)面設(shè)計(jì)的方法以溫度、pH、PAHs質(zhì)量為自變量，降解率為響應(yīng)值分析各因素之間的交互作用，分別篩選出降解蒽、芘、芴的最優(yōu)條件，為 PAHs 污染環(huán)境的微生物修復(fù)提供資源保障和科學(xué)依據(jù)。。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，簡(jiǎn)稱BT），由西北民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)部微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要藥品 蒽、芘、芴，紅四氮唑（TTC），Tris堿，甲苯（分析純），環(huán)己烷（分析純），濃硫酸，濃鹽酸，凡士林，活性炭等。

1.1.3 儀器 KRQ-400P智能型人工氣候箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；S.SW-CJ-2F凈化工作臺(tái)（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）。

1.2 方法

1.2.1 菌種復(fù)活 將蘇云金芽孢桿菌接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后待用［20]。

1.2.2 菌懸液的制備 在無(wú)菌條件下，將前期復(fù)壯的蘇云金芽孢桿菌接種于滅菌后的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，包裝后置37℃恒溫培養(yǎng)24 h備用［21]。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 從溫度，pH，PAHs質(zhì)量3個(gè)自變量入手，研究其對(duì)蘇云金芽孢桿菌降解蒽芘芴的影響。

1.2.3.1 溫度梯度設(shè)定及實(shí)驗(yàn)方法 根據(jù)芽孢桿菌的最適生長(zhǎng)溫度范圍是30-38℃［22]，故選擇單因子試驗(yàn)30、32、34、36及38℃五個(gè)梯度。

1.2.3.2 pH梯度設(shè)定及實(shí)驗(yàn)方法 根據(jù)查閱文獻(xiàn)了解到蘇云金芽孢桿菌生長(zhǎng)的最適pH為7-8［22-23]，所以設(shè)定pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0五個(gè)梯度。

1.2.3.3 PAHs質(zhì)量梯度設(shè)定及實(shí)驗(yàn)方法 根據(jù)蘇云金芽孢桿菌降解的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.5-2 g/L［24]，故設(shè)計(jì)單因子試驗(yàn)的梯度0.3、0.5、0.7和0.9 g/L 四個(gè)梯度試驗(yàn)。

1.2.4 多因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理以溫度，pH，PAHs質(zhì)量3個(gè)因素為自變量，降解率為響應(yīng)值設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析以及響應(yīng)面分析，從而優(yōu)化實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。響?yīng)面設(shè)計(jì)因素與水平如表1。

表1 試驗(yàn)因素與水平

1.2.5 模型驗(yàn)證 通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化蘇云金芽孢桿菌降解蒽、芘、芴的條件，并以優(yōu)化后的條件參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，比較模型預(yù)測(cè)值和實(shí)驗(yàn)值，從而驗(yàn)證模型的有效性。

2 結(jié)果

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 溫度單因子條件下蘇云金芽孢桿菌對(duì)蒽芘芴的降解率影響 由圖1可知，在溫度的影響下，蘇云金芽孢桿菌對(duì)芴的降解率隨溫度的升高而呈逐漸上升趨勢(shì)，但在34℃之后降解率升值減緩；對(duì)蒽的降解率的影響不太明顯，作用曲線比較平緩，說(shuō)明在溫度因素影響下蘇云金芽孢桿菌降解蒽的變化不大；而對(duì)芘的降解率的影響則出現(xiàn)了兩重性，溫度在30-34℃間降解率上升不明顯，但超過(guò)34℃時(shí)降解率明顯下降。由此可以得出蘇云金芽孢桿菌對(duì)芘的降解率最佳溫度是在34℃左右；在相同溫度影響下，蘇云金芽孢桿菌對(duì)蒽的降解率要比對(duì)芘和芴的降解率都高。對(duì)芘和芴作用在36℃左右出現(xiàn)交叉點(diǎn)。

2.1.2 pH單因子條件下蘇云金芽孢桿菌對(duì)蒽芘芴的降解率影響 據(jù)圖2分析，在同一pH值影響的條件下蘇云金芽孢桿菌對(duì)各物質(zhì)降解作用的影響也存在不同。蘇云金芽孢桿菌對(duì)蒽的作用曲線從pH在5-7時(shí)呈逐漸上升趨勢(shì)，而pH在7-9時(shí)卻有明顯下降趨勢(shì)，說(shuō)明pH7時(shí)，蘇云金芽孢桿菌對(duì)蒽的降解率最大；而蘇云金芽孢桿菌對(duì)芘的降解作用曲線在pH7之前，隨pH的增大而上升，pH在7-8時(shí)下降幅度比pH在8-9時(shí)的下降幅度大，蘇云金芽孢桿菌對(duì)芘的作用曲線在pH8之后可能有回升的趨勢(shì)，但pH在5-9范圍內(nèi)，蘇云金芽孢桿菌對(duì)芘降解率最大時(shí)的pH與物質(zhì)蒽一致，均為pH7。在pH單因素影響下，蘇云金芽孢桿菌對(duì)芴的降解率呈不斷升值狀，但在pH7前后上升趨勢(shì)有所不同。在相同pH下，蘇云金芽孢桿菌對(duì)蒽、芘的降解率較對(duì)芴的降解率高很多。

圖2 不同pH條件下蘇云金芽孢桿菌對(duì)3種物質(zhì)的降解

2.1.3 PAHs質(zhì)量單因子條件下蘇云金芽孢桿菌對(duì)蒽芘芴的降解率影響 從圖3整體來(lái)看，分別就3個(gè)不同物質(zhì)來(lái)說(shuō)，蘇云金芽孢桿菌降解蒽、芘、芴具有同步性，即隨著PAHs質(zhì)量的增加，其降解率都在逐漸下降，且呈持續(xù)下降的趨勢(shì)，只是3種物質(zhì)的下降幅度不同，對(duì)蒽和芘來(lái)說(shuō)下降比較緩慢且兩者降解率在數(shù)值上相差不大，而對(duì)芴來(lái)說(shuō)，下降坡度大，說(shuō)明所用蒽、芘、芴的量越少，其被降解的效果就越佳，這對(duì)芴的作用相對(duì)另兩種物質(zhì)更為明顯。在增加PAHs質(zhì)量為0.9 g時(shí)，蘇云金芽孢桿菌對(duì)芴的降解率已經(jīng)下降到27.63%。從圖3可以看出，蘇云金芽孢桿菌對(duì)蒽和芘的降解率在PAHs質(zhì)量為0.9 g時(shí)最小，但其最小降解率比芴的最大降解率要大，說(shuō)明同等PAHs質(zhì)量條件下蘇云金芽孢桿菌對(duì)蒽和芘的降解率均高于芴。

圖3 不同PAHs質(zhì)量條件下蘇云金芽孢桿菌對(duì)3種物質(zhì)的降解率

2.2 多因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 蒽三水平因子設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.2.1.1 蒽響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇溫度32℃、34℃、36℃，pH6.0、7.0、8.0，PAHs質(zhì)量 0.3 g、0.5 g、0.7 g 三因素三水平，利用Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)如表2。

2.2.1.2 模型的建立及顯著性檢驗(yàn)與誤差分析 根據(jù)表2中的數(shù)據(jù)可知：溫度為32.00℃，pH為7.00，PAHs質(zhì)量在0.30 g時(shí)降解率達(dá)到最大值99.70%；溫度為34.00℃，pH為6.00，PAHs質(zhì)量為0.70 g時(shí)，降解率最小為51.65%。利用 Design-Expert 8.0.6 Box-Behnken進(jìn)行回歸分析，得到蘇云金芽孢桿菌對(duì)蒽降解率的二次模型為：

對(duì)該模型進(jìn)行回歸方程系數(shù)顯著性分析見(jiàn)表3，誤差分析見(jiàn)表4。回歸模型P=0.000 6＜0.01 極顯著，表明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。失擬項(xiàng)P=0.104 3＞0.05不顯著，說(shuō)明外來(lái)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響很小。決定系數(shù)R2=95.66%，R2adj=90.07%，說(shuō)明響應(yīng)值的變化有95.66%是來(lái)源所選的變量［25]。精密度（Adeq precision）=12.438 7，是有效信號(hào)與噪音的比值，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃侠恚?6]。

表2 蒽三水平因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 回歸方程方差分析

2.2.1.3 響應(yīng)面交互作用分析 根據(jù)回歸模型，本實(shí)驗(yàn)選取交互效果最好的曲面圖和等高線圖。將PAHs質(zhì)量固定，可以得到溫度和pH兩因素交互作用的響應(yīng)面圖及對(duì)應(yīng)等高線圖，如圖4反映了溫度和pH兩因素交互對(duì)降解率的影響顯著，表現(xiàn)為其等高線為橢圓形，且響應(yīng)面曲線走勢(shì)陡。3D圖上的最大響應(yīng)值在曲面上，與沿著某一因素坐標(biāo)軸走向的最大值不重合，表明溫度、pH兩因素之間有交互影響。由響應(yīng)面曲線圖可以看出在pH為7.0-7.5，溫度在35.0-36.0℃時(shí)蘇云金芽孢桿菌對(duì)蒽的降解率最高，能達(dá)92%左右。

表4 回歸方程誤差統(tǒng)計(jì)分析

圖4 溫度和pH交互影響蘇云金芽孢桿菌降解蒽的響應(yīng)面圖及等高線圖

2.2.1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果優(yōu)化 根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到降解蒽的優(yōu)化條件為溫度35.53℃，pH為7.16，PAHs質(zhì)量0.30 g，降解率預(yù)期可達(dá)92.13%。

2.2.2 芘三水平因子設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.2.1 芘響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇溫度32、34和36℃，pH6.0、7.0、8.0，PAHs質(zhì)量0.3 g、0.5 g、0.7 g 三因素三水平利用Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)如表5。

表5 芘三水平因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.2.2 模型的建立及顯著性檢驗(yàn) 根據(jù)表5中的數(shù)據(jù)降解率在溫度為34.00℃，pH為6.00，PAHs質(zhì)量在0.30 g時(shí)達(dá)到最大值95.32%。而在溫度為36.00℃，pH為7.00，PAHs質(zhì)量為0.70 g時(shí)，降解率最小為79.16%。利用 Design-Expert 8.0.6 Box-Behnken進(jìn)行回歸分析，得到蘇云金芽孢桿菌對(duì)芘降解率的二次模型為：

對(duì)該模型進(jìn)行回歸方程系數(shù)顯著性分析見(jiàn)表6，誤差分析見(jiàn)表7。回歸模型P＜0.000 1＜0.01極顯著，表明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。失擬項(xiàng)（P=0.135 7＞0.05不顯著，即該模型在被研究的整個(gè)回歸區(qū)域內(nèi)擬合較好，因此可用該回歸方程代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。決定系數(shù)R2=97.40%，R2adj=94.05%＞80%，說(shuō)明響應(yīng)值的變化有97.40%是來(lái)源所選的變量，且只有5.95%的變異能由該模型解釋。說(shuō)明各試驗(yàn)因素與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，試驗(yàn)方法可靠。精密度（Adeq precision）=18.021 1，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合理。因此，該回歸方程可以描述各因素對(duì)蘇云金芽孢桿菌降解芘的影響，可利用該響應(yīng)面近似模型進(jìn)行后續(xù)的優(yōu)化設(shè)計(jì)。模型中B、C、AC、BC、A2、B2、C2（P＜0.01）， 說(shuō) 明 pH、PAHs質(zhì)量及兩者的二項(xiàng)式、PAHs質(zhì)量與溫度、pH交互項(xiàng)、溫度二項(xiàng)式具有極顯著影響，A、AB（P＞0.05），說(shuō)明溫度、溫度與pH交互影響不顯著，表明實(shí)驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值是一種非線性關(guān)系。

表6 回歸方程方差分析

表7 回歸方程誤差統(tǒng)計(jì)分析

2.2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析 根據(jù)芘的回歸模型，選取將PAHs質(zhì)量固定在一定水平，溫度和pH兩因素交互作用的響應(yīng)面圖及對(duì)應(yīng)等高線圖。圖5反映了溫度和pH兩因素交互對(duì)降解率的影響顯著性不是很理想，表現(xiàn)為其等高線偏離橢圓形，響應(yīng)面曲線走勢(shì)較陡，可從3D圖上中找到最大降解值。由響應(yīng)面曲線圖可以看出在pH為6.0-7.0，溫度在34.0-35.0℃蘇云金芽孢桿菌對(duì)芘的降解率最高，能達(dá)86%左右。

圖5 溫度和pH交互影響蘇云金芽孢桿菌降解芘的響應(yīng)面圖及等高線圖

2.2.2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果優(yōu)化 根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到降解芘的優(yōu)化條件為溫度35.69℃，pH為6.16，PAHs質(zhì)量0.30 g，降解率預(yù)期可達(dá)87.08%。

2.2.3 芴三水平因子設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.3.1 芴響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇溫度32、34和36℃，pH 6.0、7.0、8.0，PAHs質(zhì)量0.3 g、0.5 g、0.7 g 三因素三水平利用Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)如表8。

2.2.3.2 模型的建立及顯著性檢驗(yàn) 根據(jù)表8中的數(shù)據(jù)降解率在溫度為36.00℃，pH為6.00，PAHs質(zhì)量在0.50 g時(shí)達(dá)到最大值89.71%。而在溫度為32.00℃，pH為7.00，PAHs質(zhì)量為0.70 g時(shí)，降解率最小為41.46%。利用 Design-Expert 8.0.6 Box-Behnken進(jìn)行回歸分析，得到蘇云金芽孢桿菌對(duì)芴降解率的二次模型為：

對(duì)該模型進(jìn)行回歸方程系數(shù)顯著性分析見(jiàn)表9，誤差分析見(jiàn)表10。回歸模型P=0.013 3＜0.05，說(shuō)明試驗(yàn)所采用的二次模型是顯著的，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。失擬項(xiàng)P=0.256 0＞0.05不顯著，說(shuō)明外來(lái)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響小，可用該回歸方程代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。決定系數(shù)R2=91.65%，R2adj=86.65%＞80%，說(shuō)明響應(yīng)值的變化有91.65%是來(lái)源所選的變量，擬合度良好。因此，可用來(lái)對(duì)蘇云金芽孢桿菌降解芴的研究進(jìn)行初步分析和預(yù)測(cè)。模型中AC（P＜0.01），說(shuō)明溫度與PAHs質(zhì)量的交互項(xiàng)具有極顯著的影響，A、C、AB、A2（P＜0.05），溫度、PAHs質(zhì)量、溫度與pH交互項(xiàng)、溫度二項(xiàng)式對(duì)蘇云金芽孢桿菌降解芴影響顯著。

表8 芴三水平因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表9 回歸方程方差分析

表10 回歸方程誤差統(tǒng)計(jì)分析

2.2.3.3 響應(yīng)面交互作用分析 根據(jù)回歸模型，選取將pH固定在一定水平，溫度和PAHs質(zhì)量?jī)梢蛩亟换プ饔玫捻憫?yīng)面圖及對(duì)應(yīng)等高線圖。等高線近橢圓，反映了溫度和PAHs質(zhì)量?jī)梢蛩亟换?duì)降解率的影響顯著。在回歸方程中，二次項(xiàng)系數(shù)為負(fù)，所表現(xiàn)為響應(yīng)面曲線走勢(shì)較陡，開口向下，可以確定最大降解率。由圖6可知，在溫度為34.0-35.0℃，PAHs質(zhì)量為0.4-0.5 g時(shí)，蘇云金芽孢桿菌對(duì)芴的降解率達(dá)到最大值83%左右。

圖6 溫度和PAHs質(zhì)量交互影響蘇云金芽孢桿菌降解芴的響應(yīng)面圖及等高線圖

2.2.3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果優(yōu)化 根據(jù)Design Expert Box-Behnken design中Optimization，得到降解芴的優(yōu)化條件為溫度34.91℃，pH為7.17，PAHs質(zhì)量為0.40 g，降解率預(yù)期可達(dá)83.56%。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

同多因素實(shí)驗(yàn)方法，分別進(jìn)行3個(gè)物質(zhì)的最后驗(yàn)證試驗(yàn)（表11）。將實(shí)際的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與響應(yīng)面設(shè)計(jì)分析所得的預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，計(jì)算相對(duì)誤差，從而判斷優(yōu)化模型是否合理。

表11 模型驗(yàn)證

在驗(yàn)證試驗(yàn)中，降解蒽的優(yōu)化條件為溫度35.53℃，pH為7.16，PAHs質(zhì)量0.30 g，降解率預(yù)期可達(dá)92.13%。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)得實(shí)際值為91.60%，相對(duì)誤差在±0.58%，說(shuō)明該優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀行愿?，能夠有效預(yù)測(cè)蘇云金芽孢桿菌對(duì)蒽的降解情況。降解芘的優(yōu)化條件：溫度35.69℃，pH為6.16，PAHs質(zhì)量0.3 g，降解率預(yù)期可達(dá)87.08%。實(shí)際試驗(yàn)值為86.62%，相對(duì)誤差在±0.53%。相對(duì)誤差在±2%以內(nèi)，即可以說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷挠行?。降解芴的?yōu)化條件為溫度34.91℃，pH為7.17，PAHs質(zhì)量0.40 g，降解率預(yù)期可達(dá)83.56%，與實(shí)際試驗(yàn)值82.95%相對(duì)誤差為±0.73%。3個(gè)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷南鄬?duì)誤差均在±2%以內(nèi)，說(shuō)明33個(gè)模型有效性高，表明3個(gè)模型均能有效反映蘇云金芽孢桿菌在各自條件下對(duì)3種物質(zhì)的降解。

3 討論

當(dāng)蒽、芘及芴的濃度達(dá)到 0.9 g/L 時(shí)，蘇云金芽孢桿菌對(duì)其三者的降解效果明顯降低，這可能是由于有毒有害的代謝產(chǎn)物在高濃度芘降解過(guò)程中積累，對(duì)微生物的生長(zhǎng)及對(duì)3種物質(zhì)的利用產(chǎn)生了一定的抑制作用。陳曉鵬等［27]和Lu等［28]的相關(guān)研究也表明，微生物在降解芘的過(guò)程中，降解效果隨著芘初始濃度的升高而降低。

另外，響應(yīng)面方法RSM 也是一種尋找多因素系統(tǒng)中最佳條件的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法，是數(shù)學(xué)方法和統(tǒng)計(jì)方法結(jié)合的產(chǎn)物，已被廣泛應(yīng)用到微生物培養(yǎng)基優(yōu)化中，但以響應(yīng)曲面法來(lái)優(yōu)化芘共代謝降解條件的研究比較少。因此，本次實(shí)驗(yàn)主要利用Design Expert 8.0.6.1軟件中的Box-Behnken設(shè)計(jì)版塊對(duì)前期實(shí)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)以及對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了方差分析以及對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行了優(yōu)化。在多因素實(shí)驗(yàn)中，不同物質(zhì)在不同條件交互影響下降解效果不同。對(duì)于蒽物質(zhì)來(lái)說(shuō)，溫度和pH交互作用的響應(yīng)面曲線較陡，等高線近橢圓且變化較稀疏，說(shuō)明溫度和pH交互項(xiàng)對(duì)降解率影響顯著；對(duì)芘來(lái)講，響應(yīng)面曲線較陡，等高線偏離橢圓形，說(shuō)明溫度與pH兩者的交互作用微弱，表明溫度和pH對(duì)降解率峰值的影響不太大；對(duì)于芴，溫度與PAHs質(zhì)量?jī)梢蛩亟换プ饔脤?duì)降解率的影響顯著。且從回歸方程可見(jiàn)，各具體實(shí)驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，二次項(xiàng)和交互項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值都有很大關(guān)系。因?yàn)榛貧w方程中各項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值的大小也直接反映各因素對(duì)響應(yīng)值影響程度，系數(shù)的正負(fù)反映了影響的方向［29]。殘差分析是借助圖形分析工具進(jìn)行評(píng)價(jià)的，殘差分析可以診斷響應(yīng)面優(yōu)化模型的正確性［30-31]，正確合理的模型要求殘差呈正態(tài)概率分布且誤差方差齊性檢驗(yàn)合理. 此方面與國(guó)外微生物菌系降解多環(huán)芳烴方面的研究較近，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景［32-33]。在驗(yàn)證試驗(yàn)中，3種物質(zhì)在相應(yīng)的優(yōu)化條件下的實(shí)際降解率值與響應(yīng)面預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差均在2%以內(nèi)，說(shuō)明該優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀行愿撸砻?個(gè)模型均能有效反映蘇云金芽孢桿菌在不同條件下對(duì)3種物質(zhì)的降解，并可將此實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ屯度氪笮蛯?shí)驗(yàn)田中。因此，選用響應(yīng)面優(yōu)化分析多種共代謝底物對(duì)降解率的影響，可有效提高微生物對(duì)難降解有機(jī)物的降解率，為治理PAHs 污染土壤提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究表明，溫度與pH交互項(xiàng)對(duì)蒽、芘的降解影響顯著，溫度與PAHs質(zhì)量交互對(duì)芴的降解影響顯著。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，3個(gè)優(yōu)化模型相對(duì)誤差均在2%以內(nèi)，表明3個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ途捎糜诜治黾邦A(yù)測(cè)蘇云金芽孢桿菌對(duì)蒽芘芴的降解效果。