基于轉(zhuǎn)錄組測序的岡田繞眼果蠅aoattacin基因篩選及在昆蟲細胞中表達、抑菌活性檢測

蔡娟 劉流 王靈軍 曹建平 鄭明輝， 劉暉

（1. 遵義醫(yī)科大學(xué)，遵義 563003；2. 中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所，上海 200025）

岡田繞眼果蠅（Amiota okadai），屬于雙翅目蠅科（Diptera），雖然在我國呈分散分布，但卻與人類生活密切相關(guān)。不僅由于它們攜帶成百上千種病菌，能夠傳播多種疾病，更因其作為結(jié)膜吸吮線蟲的中間宿主［1]，與近年來結(jié)膜吸吮線蟲病例的局部流行密切相關(guān)［2]。蠅類通常在腐敗、骯臟的惡劣環(huán)境下生活，但種群卻十分強大，重要原因就是由于其具有強大的先天免疫系統(tǒng)，可以有效地抵御異源侵擾［3-4]。昆蟲具有識別細菌、真菌、病毒及寄生蟲等病原體的有效機制，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑引發(fā)一系列的細胞免疫和體液免疫反應(yīng)，其中體液免疫中關(guān)鍵的抗菌因子-抗菌肽，在先天免疫中占據(jù)十分重要的地位［5-6]。

抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs），是一類低分子量的短肽，大多數(shù)是由陽離子和疏水性殘基組成的兩親分子［7-8]。由于其對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、絲狀真菌、原生生物以及包膜病毒在內(nèi)的微生物都具有快速且有效的殺傷效果，因此被稱為“自然抗生素”［9]，因其多通過靜電和疏水作用吸附于細菌細胞膜，進而破壞膜結(jié)構(gòu)發(fā)揮活性，而這種獨特的作用機制使細菌很難通過改變細胞膜成分對抗菌肽產(chǎn)生耐藥性［10]，因此抗菌肽大有成為傳統(tǒng)抗生素理想替代品的趨勢。此外，由于近年來抗生素的濫用，耐藥細菌已成為嚴重危害人類健康的問題，因此鑒定和開發(fā)新的抗菌劑也亟待解決［11]。但由于天然抗菌肽在生物體內(nèi)含量較低，直接提取步驟繁瑣且效率低、成本高，提取物的純度也難以保證，因此規(guī)?；a(chǎn)短期還難以實現(xiàn)［12]。目前的研究表明基因工程抗菌肽替代天然抗菌肽在理論和實踐上都已成為可行。因而通過基因克隆、表達的方式獲取目的抗菌肽，越來越受到人們的重視［13]。目前用于表達抗菌肽的基因工程表達系統(tǒng)有原核和真核兩種，其中真核表達系統(tǒng)除了具有蛋白表達水平高、生產(chǎn)成本低的特點，還能夠?qū)Ρ磉_產(chǎn)物進行翻譯后的加工，從而保證了表達產(chǎn)物活性高［12]。利用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達抗菌肽是當(dāng)前抗菌肽基因工程表達研究中應(yīng)用較廣泛的方法［14]。

目前已鑒定的蠅類中的抗菌肽有 attacin、cecropin［15]、diptericin［16]、defensin［17]、MDAP-2D［18]及 Muscin 等。本實驗室通過生物信息學(xué)方法鑒定了轉(zhuǎn)錄組文庫中多個和前述抗菌肽同源的unigene，隨后通過差異表達譜分析篩選出一個表達量高且有顯著差異的基因unigene6686_AO-1，將其命名為aoattacin（未發(fā)表數(shù)據(jù)），通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該基因氨基酸序列具備分子量小、富含脯氨酸、疏水性氨基酸等較多抗菌肽的特征，本研究利用昆蟲細胞Sf9真核表達系統(tǒng)對其進行體外表達，并對其生物活性進行鑒定，為相關(guān)抗生素替代品的研發(fā)和應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

岡田繞眼果蠅：由本實驗室保種和飼養(yǎng)，幼蟲使用發(fā)酵1-2 d的蘋果、香蕉、梨果塊進行飼養(yǎng)，每2 d換一次水果。飼養(yǎng)溫度25-30℃，相對濕度70%-80%，光照8 h/d［1]。抑菌實驗菌種：抑菌實驗所用菌種由中國疾病預(yù)防控制中心曹建平研究員和遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院宋鴻教授饋贈。革蘭氏陽性菌：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、脲芽孢八疊球菌（Sporosarcina ureae）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、藤黃微球菌（Micrococcus luteus）、氧化微桿菌（Microbacterium oxydans）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）；革蘭氏陰性菌：傷寒桿菌（Salmonella typhi）、銅假綠單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、痢疾菌屬（Shigellasp.）、大腸桿菌（Escherichia coli）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）、雞傷寒沙門氏菌（Salmonella gullinarum）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）、變形菌（Proteus species）、穩(wěn)定伯克霍爾德菌（Burkholderia stabilis）、黏質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）；aoattacin基因、Sf9細胞、質(zhì)粒pFastbac1、E.coli DH10Bac感受態(tài)細胞、AB-PCR儀（北京世紀科信科學(xué)儀器有限公司）；Tanon-1600凝膠成像儀（廣州譽維生物科技儀器有限公司）；DYY-8C電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；SW-CJ-ID超凈工作臺（蘇州江東精密儀器有限公司）；HH-3D恒溫水浴鍋（江蘇科析儀器有限公司）；GHP-9160培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；Thermo離心機（賽默飛世爾科技（中國）有限公司）；BIC-400人工氣候箱（上海博迅公司）；HR40-II A2生物安全柜（青島海爾特種電器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 岡田繞眼果蠅總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 果蠅培養(yǎng)在遵義醫(yī)科大學(xué)-貴州省普通高等學(xué)校傳染病與生物安全特色重點實驗室（BSL-2）的人工氣候箱中進行［1]，選擇3齡果蠅幼蟲采用RNA提取試劑盒（北京莊盟）提取總RNA，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性后，利用核酸定量儀測定其濃度和純度，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京莊盟）合成 cDNA。

1.2.2 抗菌肽aoattacin基因的篩選、分析、驗證及合成 利用轉(zhuǎn)錄組中unigene的注釋文庫結(jié)合已知的抗菌肽基因序列做序列查詢，利用BLASTp從轉(zhuǎn)錄組里篩選到5個抗菌肽aoattacin同源基因。為了進一步確定篩選的序列為抗菌肽序列，使用MEGA 5.0 軟件構(gòu)建基因家族系統(tǒng)進化樹，分析基因的同源性。通過轉(zhuǎn)錄組中的表達量及表達譜分析，篩選到一個高表達的aoattacin基因，通過PCR進行驗證。隨后對候選的aoattacin基因進行密碼子優(yōu)化，送成都擎科生物科技有限公司進行全基因合成，合成時分別在5'端添加BamH I酶切位點和信號肽序列，3'端添加EcoRI 酶切位點和6個His標(biāo)簽，引物為aoatt-F：5'-TTCATACCGTCCCACCATCGGGCGC GGATCCATGGAGTCCCACATGCTGCTGTTCCTGTT-3'：aoatt-R：5'-GCTCGTCGACGTAGGCCTTTGAATTCT CAGTGATGGTGGTGGTGGTGGCAGATCCAGGAA-3'。合成序列的測序驗證由成都擎科生物科技有限公司完成。

1.2.3 重組質(zhì)粒pFast-bac1-aoattacin的構(gòu)建及鑒定BamHI和EcoRI雙酶切aoattacin基因與pFastbac1載體后，進行連接（基因2 μL、載體100-200 ng、ligase buffer 2 μL、T4 ligase 2 μL、20 μL 總 體積，16℃過夜），將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞。PCR驗證單克隆菌落，引物序列為：pbattF：5'-AAATGATAACCATCTCGC-3'；pbattR：5'-TTCAGGTTCAGGGGGAGGTG-3'。用SnaB I和Hind III進行雙酶切鑒定，測序驗證由成都擎科生物科技有限公司完成。

1.2.4 重組Bacmid的構(gòu)建及鑒定 將20 ng的pFast-bac1-aoattacin加入大腸桿菌 DH10Bac感受態(tài)細胞中，進行藍白斑及抗生素篩選實驗。對得到的8個陽性克隆提取質(zhì)粒進行PCR驗證。引物為 M13-F：5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3'，M13-R：5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'，測序驗證由成都擎科生物科技有限公司完成。

1.2.5aoattacin基因在Sf9細胞中表達及驗證 細胞轉(zhuǎn)染及P1、P2代病毒擴增：取對數(shù)生長期、活力大于95%的Sf9細胞接種（9×105個細胞/2 mL/孔）于六孔板中，制備Bacmid與Cellfectin?II Reagent復(fù)合物，用SF 900Ⅱ（不含雙抗）培養(yǎng)基稀釋后，加到每個孔中，27℃孵育5 h，去掉復(fù)合物混合液，加入SF 900Ⅱ（含雙抗）培養(yǎng)基，27℃濕度孵育至細胞出現(xiàn)病毒感染跡象，收獲P1代病毒（106pfu/mL，1 000 r/min，離心5 min，用0.2 μm的濾膜過濾上清）；繼續(xù)擴增P1代病毒到P2代（1×107-1×108pfu/mL）。Aoattacin的表達、純化：接種活力大于95%的Sf9細胞2×106個至200 mL搖瓶，待細胞生長至對數(shù)期，加入P2代病毒（1∶100，培養(yǎng)72 h），離心收集細胞和培養(yǎng)基上清提取細胞裂解物粗蛋白（參照昆蟲蛋白提取試劑盒說明書操作）。鎳柱親和層析純化后，對抗菌肽進行SDS-PAGE及Western Blot檢測、純化。MOI優(yōu)化：在分析Aoattacin表達過程中，發(fā)現(xiàn)不同的條件導(dǎo)致不同的表達水平。為了優(yōu)化Aoattacin的表達，對Sf9細胞（活力大于95%，2×106個）接種至30 mL搖瓶生長至對數(shù)期，分別按照1∶20、1∶100、1∶500的比例加入P2代病毒，感染48 h、72 h后離心收集細胞和培養(yǎng)基上清，設(shè)定alpha-L-fucosidase作為陽性對照，進行Western Blot檢測，檢測目的蛋白表達量并純化。

1.2.6 Aoattacin的抑菌活性檢測 將抑菌實驗菌株在LB培養(yǎng)基中（200 r/min，37℃）培養(yǎng)10 h，按照1%的接種量轉(zhuǎn)接培養(yǎng)（OD600≈0.2），新鮮LB培養(yǎng)基稀釋菌液×100備用。將純化的Aoattacin蛋白用無菌水進行稀釋，取90 μL細菌稀釋液和10 μL蛋白稀釋液加入96孔板中，23℃ 100 r/min培養(yǎng)12 h。分別以 10 μL 無菌水和 10 μL 氨芐青霉素（30 μg/mL）作為陰性和陽性平行對照。在利用分光光度計OD600下檢測實驗組和對照組菌液的濁度，來判斷其是否具有抑菌活性，并測定最小抑菌濃度（MIC），把與陰性對照組相比實驗組達到85%以上細菌死亡的多肽濃度定義為最小抑菌濃度（MIC，每組3次實驗重復(fù)），實驗及菌種保存均在衛(wèi)生部寄生蟲病原與媒介生物學(xué)重點實驗室（BSL-2）的生物安全柜中進行。

2 結(jié)果

2.1 抗菌肽基因的篩選、分析及全基因合成

通過同源注釋及從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中挑選出來的aoattacin基因包含以下5個：CL948.Contig1_AO-1、CL948.Contig2_AO-1、Unigene30284_AO-1、Unigene6686_AO-1、Unigene9478_AO-1，為避免注釋的錯誤，我們從BLASTp比對序列中，選取了2個高同源性、高置信的外源attacin基因作為參考序列（E value = 0）進行系統(tǒng)進化分析，結(jié)果證明了BLAST比對和數(shù)據(jù)庫中的注釋結(jié)果，岡田繞眼果蠅的5個抗菌肽基因聚在一個進化樹分支，與2個外源參考序列明顯分開（圖1）；PCR進行驗證候選unigene6686_AO-1（1 200 bp），長度及測序結(jié)果與預(yù)期一致（圖2-A）；選擇其中最長的ORF，經(jīng)密碼優(yōu)化后添加信號肽、His標(biāo)簽、BamH I和EcoR I 酶切位點后進行全基因合成，合成后的產(chǎn)物通過電泳（圖2-B）及測序驗證，結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致，并且未發(fā)現(xiàn)堿基突變和缺失。

圖1 aoattacin基因系統(tǒng)進化樹

2.2 重組質(zhì)粒pFast-bac1-aoattacin的構(gòu)建及鑒定

陽性克隆的PCR結(jié)果（圖3-A）顯示目的條帶在約1 000 bp位置，符合預(yù)期，序列測序驗證結(jié)果也表明目的基因序列成功連接至載體上；將重組質(zhì)粒用SnaBI和Hind III雙酶切，電泳結(jié)果表明目的基因（約750-1 000 bp）和質(zhì)粒（約3 000-5 000 bp）條帶均符合預(yù)期（圖3-B），測序驗證也顯示序列與預(yù)期序列一致，說明重組質(zhì)粒pFast-bac1-aoattacin構(gòu)建成功。

圖2 候選aoattacin基因的PCR鑒定（A）、全基因合成aoattacin基因的瓊脂糖凝膠電泳鑒定（B）

圖3 菌落PCR結(jié)果（A）、重組質(zhì)粒雙酶切鑒定（B）

2.3 重組Bacmid的構(gòu)建及鑒定

對陽性單克隆菌落的質(zhì)粒進行PCR并測序驗證，電泳結(jié)果（圖4）顯示在3 000 bp處出現(xiàn)明顯條帶，符合預(yù)期（理論2 936 bp），測序結(jié)果也顯示與預(yù)期序列一致，說明重組Bacmid構(gòu)建成功。挑選DNA濃度最高的菌落（8號）進行后續(xù)實驗。

圖4 重組Bacmid PCR鑒定

2.4 Aoattacin蛋白的表達、純化與分析

利用SDS-PAGE對鎳柱親和層析純化前后的培養(yǎng)上清及細胞進行檢測：在培養(yǎng)基及細胞破碎后的上清中無明顯目的蛋白條帶（圖5-A）；Western Blot顯示該蛋白在細胞破碎離心后沉淀樣中存在（圖5-B），上述結(jié)果表明Aoattacin蛋白為跨膜蛋白但表達量不高。分析了Aoattacin的表達過程，發(fā)現(xiàn)不同的條件導(dǎo)致不同的表達水平，進一步通過MOI優(yōu)化表達條件，但產(chǎn)量沒有明顯提高（圖6）。

圖5 SDS-PAGE（A）及Western Blot（B）檢測200 mL細胞表達純化

2.5 抑菌活性檢測

純化的岡田繞眼果蠅抗菌肽Aoattacin對各種細菌的最小抑菌濃度（MIC）見表1，實驗表明Aoattacin對金黃色葡萄球菌在內(nèi)的20種受試細菌都具有抑菌作用，其中對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌抑制作用最強，MIC值為0.68 μmol/L，對革蘭氏陰性菌黏質(zhì)沙雷氏菌的抑制作用最弱，其MIC值為11.25 μmol/L。結(jié)果顯示岡田繞眼果蠅抗菌肽Aoattacin對革蘭氏陽性菌的抑制效果要更好。

圖6 MOI優(yōu)化表達及檢測

3 討論

岡田繞眼果蠅作為一種重要的醫(yī)學(xué)昆蟲，是結(jié)膜吸吮線蟲主要傳播媒介。雖然其分布有著局部分散的特點，但由于結(jié)膜吸吮線蟲病例的日趨增多，其越來越多引起我們的研究。由于其飼養(yǎng)簡單，繁殖能力強，還有通過我們前期組學(xué)分析從其中鑒定了多種抗菌肽序列，因此它有望繼家蠅之后成研究抗菌肽的蠅類資源之一?？咕淖鳛橐活悘V泛存在于自然界生物體中的小分子多肽類物質(zhì)，是機體先天性免疫的重要組成部分［19-20]。由于多重耐藥病原體的出現(xiàn)和傳播，昆蟲抗菌肽成了替代抗生素的潛在生物資源庫，以解決當(dāng)前抗生素的局限性［21]。雖然可以通過化學(xué)合成方法獲得抗菌肽，但由于化學(xué)合成結(jié)構(gòu)的差異，往往需要對其結(jié)構(gòu)進行修飾后才具有活性。如化學(xué)合成的線性抗菌肽1-Muscin無抑菌活性，而經(jīng)過環(huán)化修飾后的c-Muscin才對多種細菌有抑制作用［22]。而利用原核表達系統(tǒng)，由于其細胞缺少蛋白質(zhì)的翻譯后加工修飾過程，表達真核來源的蛋白可能會影響表達產(chǎn)物的生物活性，另外，由于抗菌肽強烈的抑菌活性，有時也會在其表達過程中將宿主殺死，使得重組表達難以在原核微生物中進行。真核表達系統(tǒng)則具有蛋白質(zhì)的翻譯后加工修飾過程，表達產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物化學(xué)功能等方面與天然蛋白分子相近，被廣泛使用。昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)使用的昆蟲細胞可在無二氧化碳條件27℃進行貼壁或懸浮培養(yǎng)，操作相對簡單，工業(yè)化生產(chǎn)方面具有天然優(yōu)勢，且昆蟲細胞培養(yǎng)及操作較簡便，成本低，因此被廣泛用于生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品。目前，全世界的學(xué)者已從100多種昆蟲中建立了500多株細胞系。在國內(nèi)也有20多個昆蟲細胞系建立。由于Spodoptera frugiperda細胞株Sf9 和 Sf21 以及Trichoplusia ni細胞株 High Five 和Tn-368 對AcMNPV 非常敏感，因而它們是桿狀病毒表達系統(tǒng)中常用的昆蟲細胞［23]。此外，抗菌肽數(shù)據(jù)庫（APD：http：//aps.unmc.edu/AP/main.php） 中 已經(jīng)收集了大約2 600種抗菌肽。然而昆蟲的AMPS種類不到10%，因此對昆蟲AMPS的研究對AMPS的認識和應(yīng)用具有重要意義［24]。隨著抗菌肽的深入研究和基因工程的廣泛應(yīng)用，昆蟲抗菌肽的功能、工作機制將更加明確，其應(yīng)用也將更加多樣、廣泛。

表1 岡田繞眼果蠅Aoattacin對于細菌的最小抑菌濃度（MIC）

本課題組前期利用化學(xué)合成方法獲得的抗菌肽Aoattacin蛋白對表1中的待選細菌，如：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、穩(wěn)定伯克霍爾德菌（Burkholderia stabilis）、雞傷寒沙門氏菌（Salmonella gullinarum）、棲冷克呂沃爾菌（Kluyvera cryocrescens）等的最低抑菌濃度均大于100 μmol/L（未發(fā)表數(shù)據(jù)），可以認為對這些細菌沒有起到抑制作用。而本研究中通過昆蟲細胞表達Aoattacin對上述細菌都具有很強的抑制效果，這表明與合成抗菌肽相比，真核細胞表達的Aoattacin抑菌譜更廣。此外，通過真核表達系統(tǒng)表達家蠅Aoattacin的研究目前報道也較少，較為成功的有中國倉鼠卵巢細胞（CHO）中穩(wěn)定表達家蠅抗菌肽Attacin的報道［25]，而本實驗成功將包含岡田繞眼果蠅抗菌肽aoattacin基因的桿狀病毒表達載體轉(zhuǎn)染到Sf9細胞，通過Western Blot對目的蛋白表達情況檢測時發(fā)現(xiàn)目的條帶的位置與預(yù)測分子量（34 kD）有所偏差，我們推測由于真核表達蛋白存在一定后期修飾造成的分子量變化，后續(xù)我們也正在利用質(zhì)譜法對該蛋白進行鑒定以證實其修飾方式。表達的Aoattacin蛋白的分子量與預(yù)測的大小基本一致，表明 Bacmid 重組質(zhì)粒在昆蟲Sf9細胞中成功表達。雖然經(jīng)過前期密碼子及MOI的優(yōu)化，但結(jié)果仍然顯示aoattacin基因在Sf9細胞中表達量較小，距離后期進行規(guī)?；a(chǎn)仍有一定難度，但本實驗也為后續(xù)規(guī)?；a(chǎn)提供了基礎(chǔ)實驗數(shù)據(jù)的參考。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了岡田繞眼果蠅抗菌肽Aoattacin成熟肽在昆蟲細胞Sf9中的表達載體，誘導(dǎo)表達后進行蛋白檢測，Tricine-SDS-PAGE 及Western Blot分析結(jié)果表明aoattacin基因在昆蟲細胞Sf9中成功表達，抑菌實驗顯示Aoattacin對受試革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌都具有抑制作用，是一種新型廣譜抗菌肽。