黃芪根腐病生防芽孢桿菌的篩選鑒定與盆栽防效試驗

趙曉霞 牛世全 文娜 蘇鋒鋒

（西北師范大學生命科學學院，蘭州 730070）

黃芪（Astragalus membranaceus），多年生草本植物，具有滋補等藥用功效。近年來，因栽培、連作面積增多，致使黃芪病害加重，其中根腐病是影響黃芪產量與品質的主要病害之一。黃芪根腐病發(fā)生在整個生育時期，發(fā)病過程是由根莖向下，由主根向側根蔓延，根表面出現(xiàn)病斑且表皮粗糙，對病株的根部進行裝片制作觀察病根結構，發(fā)現(xiàn)病株維管束組織變褐色，有明顯被溶解的現(xiàn)象。黃芪根腐病病原菌包括茄腐鐮刀菌（Fusarium solaniun）和尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）等［1]。目前對黃芪根腐病的防治主要是化學農藥防治，但隨著現(xiàn)代生態(tài)農業(yè)的發(fā)展，生物防治體現(xiàn)出其優(yōu)勢。因此，探索有效的生物防治方法正逐漸引起人們的重視。本研究以實驗室保存的從敦煌地區(qū)鹽堿土壤中分離篩選出的21株芽孢桿菌為實驗材料，研究該類菌對黃芪根腐病病原菌的抑制作用，并篩選出對黃芪根腐病病原菌具有較好防治效果的拮抗芽孢桿菌菌株，以期為黃芪根腐病的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：去皮馬鈴薯20 g，葡萄糖2.0 g，瓊脂1.5-2.0 g，水100 mL，pH自然；牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（NA）：牛肉膏0.5 g，蛋白胨1.0 g，NaCl 0.5 g，瓊脂1.5-2 g，水100 mL，pH 7.0；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NB）：牛肉膏0.5 g，蛋白胨1.0 g，NaCl 0.5 g，水100 mL，pH 7.0。

1.1.2 供試菌株 芽孢桿菌：敦煌地區(qū)鹽堿土壤中分離篩選得到21株芽孢桿菌，由本實驗室保存。指示病原菌：分離自甘肅隴西黃芪1號栽培基地的黃芪根腐病病原菌G2茄腐鐮刀菌（F. solaniun），由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 生防芽孢桿菌的初篩 將保存的21株芽孢桿菌接于NA平板，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中活化24 h后備用，黃芪根腐病病原菌G2在PDA平板，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中活化6 d后備用。采用平板對峙法［2]測定21株芽孢桿菌對黃芪根腐病原菌G2抑菌率，各處理3次重復，在28℃恒溫培養(yǎng)5 d。計算公式：抑菌率 =（對照組直徑-試驗組直徑）/對照菌落直徑 ×100%［2]。

1.2.2 生防芽孢桿菌的復篩 選擇初篩中抑菌率大于70%的菌株進行復篩，將活化后待篩選的拮抗芽孢桿菌分別接入等量的NB液體培養(yǎng)基中，在37℃，160 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)48 h后，將培養(yǎng)好的菌液在4℃，10 000 r/min離心10 min，棄去沉淀，上清液用0.22 μm的微孔濾器過濾，得到無菌上清液，備用［3]。

采用瓊脂擴散法，將PDA培養(yǎng)基在滅菌后冷卻至50℃左右，以200∶1的比例加入病原真菌菌懸液，混合均勻后倒入已用水瓊脂作為底層的培養(yǎng)皿中，制備帶菌平板，待平板凝固后，用已滅菌的打孔器在平板上打孔，向孔內加入200 μL發(fā)酵上清液，以加入等量無菌水作為對照組，各處理3次重復。在28℃恒溫培養(yǎng)3 d后，利用上述計算公式測定抑菌率，篩選出對黃芪根腐病病原菌G2拮抗作用最強的菌株。

1.2.3 菌體形態(tài)觀察 將優(yōu)勢生防芽孢桿菌接種于NA培養(yǎng)基平板，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，再對菌株進行革蘭氏染色、鏡檢，觀察優(yōu)勢生防芽孢桿菌的菌落、菌體形態(tài)特征。

1.2.4 生理生化特征測定 根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》［4]與《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》［5]對篩選出來的優(yōu)勢生防芽孢桿菌株進行明膠液化、淀粉水解等生理生化鑒定。

1.2.5 1 6S rDNA 基因序列分析 采用土壤DNA小量提取試劑盒提取細菌DNA，采用16S rDNA細菌通用引物27F/1492R進行PCR擴增。PCR反應體系（30 μL）：模板 DNA 4 μL，引物各 1 μL，Taq 酶15 μL，ddH2O 9 μL ；反應參數(shù) ：95℃ 5 min；95℃1 min，57℃ 1 min，72℃ 2 min， 共 25個 循 環(huán) ；72℃總延伸10 min。PCR 擴增后，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，將擴增產物送至甘肅中鼎森生物科技有限公司測序，經過NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對分析，利用MEGA7.0軟件，設置Bootstrap values為1 000，使用鄰近法方法構建系統(tǒng)發(fā)育樹［2]。

1.2.6 拮抗芽孢桿菌的盆栽防效試驗 通過黃芪苗盆栽試驗測定拮抗芽孢桿菌對該病原菌的防治作用。（1）病原菌孢子懸液的制備：分別刮取PDA平板上28℃，培養(yǎng)10 d的病原菌，將其分散到6 g/L CMC（羧甲基纖維素鈉）溶液中制成孢子懸液，孢子濃度調至 2.0×107CFU/mL［6]。（2）盆栽試驗設計 ：從甘肅隴西黃芪1號栽培基地選取長勢一致的健康蒙古黃芪苗分成3組，即空白組（不接菌種）、對照組（接種病原菌）、試驗組（接種病原菌和拮抗芽孢桿菌），每處理12盆，每盆3株，幼苗移栽至裝有混合營養(yǎng)土（營養(yǎng)土∶蛭石∶珍珠巖=3∶1∶1）的塑料小花盆中，14 d后采取傷根灌注法［7]向對照組和試驗組接種上述病原菌孢子懸液，每盆接種量均為5 mL，以接等量無菌水為對照。接種病原菌14 d后，分別向每盆試驗組接種5 mL拮抗芽孢桿菌發(fā)酵濾液，以接等量無菌水為空白對照。（3）防效測定：培養(yǎng)28 d后觀察統(tǒng)計發(fā)病情況，按照植物病害分級標準計算防治效果。黃芪根腐病分級標準為0級，無病斑；1級，有病斑1%-5%；2級，有病斑6%-10%；3級，有病斑11%-20%；4級，有病斑21%-40%；5級，有病斑41%-60%；6級，病斑61%-80%；7級，81%以上。計算公式：發(fā)病率 = 發(fā)病植株數(shù)/調查總株數(shù)×100%；病情指數(shù)=∑（病級總株數(shù)×發(fā)病級別）/（調查總株數(shù)×最高級別）×100%；防治效果 =（對照病情指數(shù)-試驗病情指數(shù)）/對照病情指數(shù) ×100%［8]。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行方差分析，處理間差異的多重比較采用Duncan氏新復極差法。

2 結果

2.1 優(yōu)勢生防芽孢桿菌篩選結果

通過對21株供試芽孢桿菌的初步篩選，獲得了10株對黃芪根腐病病原真菌茄腐鐮刀菌G2抑菌效果較好的芽孢桿菌，其抑菌率大于90%（表1）；為了進一步研究初篩菌株對該病原菌的拮抗能力與分泌產抗物質能力的大小，通過瓊脂擴散法進行復篩，發(fā)現(xiàn)菌株7-2-1-6的發(fā)酵上清液對茄腐鐮刀菌拮抗活性較高，抑菌圈直徑大且清晰，能很大程度的抑制茄腐鐮刀菌的生長，其發(fā)酵上清液抑菌率達85.40%（圖 1）。

表1 拮抗芽孢桿菌對黃芪根腐病菌G2的抑制作用

2.2 菌株7-2-1-6的形態(tài)特征

菌株7-2-1-6在NA培養(yǎng)基上菌落為乳白色，不透明，邊緣不規(guī)則，表面光滑，質地黏稠。進行革蘭氏染色后，在光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)（圖2），菌體短桿狀、呈紫紅色，因此，菌株7-2-1-6是革蘭氏陽性細菌。

圖1 菌株7-2-1-6的發(fā)酵液抑菌效果

圖2 菌株7-2-1-6菌落（A）菌體（B）形態(tài)

2.3 菌株7-2-1-6的生理生化特征

菌株7-2-1-6生理生化特征結果如表2所示。

表2 拮抗芽孢桿菌菌株7-2-1-2的生理生化特性

2.4 菌株7-2-1-6 16S rDNA基因序列分析結果

經過對菌株7-2-1-6的16S rDNA 基因序列測定及分析，并構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。菌株7-2-1-6與Bacillus subtilis（KX427024.1）屬同一個分支，結合形態(tài)特征與生理生化，可以鑒定菌株7-2-1-6為枯草芽孢桿菌（B. subtilis）。

圖3 菌株7-2-1-6的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 菌株7-2-1-6對黃芪根腐病盆栽防效測定結果

通過對盆栽黃芪植株生長發(fā)病情況的觀察記錄，在第28天的生長發(fā)病情況如表3所示。

表3 菌株7-2-1-6對黃芪根腐病盆栽防治效果

通過盆栽試驗測定了菌株7-2-1-6對黃芪根腐病的防治效果。結果顯示對照組黃芪幼苗的株高和主根長明顯小于空白組和試驗組的株高和主根長，對照組和試驗組的顯著差異表明（圖4），菌株7-2-1-6能顯著降低黃芪根腐病的發(fā)病程度，防治效果達到68.80%（表3），說明菌株7-2-1-6對黃芪根腐病具有較好的防治作用。

圖4 黃芪根腐病拮抗菌盆栽防效試驗

3 討論

芽孢桿菌是一類重要的具有生物研究價值的微生物資源，大部分生防芽孢桿菌對環(huán)境適應性強，繁殖速度快、具有抗逆性，同時可以產生多種抗菌物質［9]，在植物病害防治中有很高的應用價值，陳倩倩等［10]發(fā)現(xiàn)暹羅芽孢桿菌（B. siamensis）分泌的活性物質能抑制尖孢鐮刀菌；陳志杰等［3]發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌4-z-3發(fā)酵液中的抗菌物質對多種植物病原真菌都有明顯的抑菌作用；李玉聰?shù)龋?1]研究發(fā)現(xiàn)甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（B. methylotrophicus）對馬鈴薯瘡痂病具有較好的防治作用；雷白時等［12]研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌HD-5對草莓根腐病病原菌尖孢鐮刀菌有抑制作用，盆栽防治效果達77.78%。

本研究篩選鑒定出枯草芽孢桿菌7-2-1-6分離自敦煌地區(qū)鹽堿土壤中，是典型的極端環(huán)境，相比于自然條件下微生物而言，在鹽堿土壤等極端環(huán)境條件下生長的微生物具有特殊的生理功能、遺傳特性及代謝方式等，因為它們?yōu)榱诉m應惡劣極端的外界環(huán)境，經過長期的生長和變化，產生了特殊的生理機能和代謝體系，所以極端環(huán)境中的微生物能夠將產生大量的活性物質，對于生物防治的應用具有更大的潛能［13]。張飛鵬等［14]從大慶地區(qū)鹽堿土壤中分離出一株芽孢桿菌B. brevi優(yōu)勢種；董艷萍等［15]在塔克拉瑪干沙漠南麓及羅布泊地區(qū)分離出很多可能產生新的活性物質的放線菌；賈麗［16]從我國西部極端環(huán)境鹽湖區(qū)分離篩選出一定數(shù)量的耐高糖芽孢桿菌。

目前，對黃芪根腐病的防治主要采用化學農藥防治，而化學防治不僅會造成農藥殘留污染環(huán)境，還會使病原菌產生抗藥性，甚至會降低品質［17]。鑒于此，通過拮抗微生物進行生物防治已成為研究的熱門課題，高芬等［18]研究發(fā)現(xiàn)PGPR菌G10對黃芪根腐病病原菌有拮抗作用；牛世全等［19]研究發(fā)現(xiàn)藍紫鏈霉菌（Streptomyces tuirus）對黃芪根腐病的2種致病菌均有較好的抑制作用；鄭豆豆等［20]通過盆栽試驗驗證的放線菌菌株DA4-3-12、DA8-4-10和221對黃芪根腐病的防效分別為60.1%、46%和69.99%。本研究以黃芪根腐病病原真菌茄腐鐮刀菌G2為防治對象，通過平板對峙法和瓊脂擴散法篩選得到一株生防芽孢桿菌7-2-1-6，該生防菌株發(fā)酵上清液對黃芪根腐病病原真菌茄腐鐮刀菌G2的抑制率為85.40%，通過對該生防菌株的相關研究鑒定為枯草芽孢桿菌（B.subtilis），同時，經盆栽防效測定對黃芪根腐病防治效果約68.80%，具有良好的應用前景，為黃芪根腐病的生物防治提供菌種資源。雖然菌株7-2-1-6盆栽試驗中表現(xiàn)出較好的防治效果，但在實際生物防治過程中的施用濃度、方法、土壤類型及對生態(tài)環(huán)境的影響等還需要進一步驗證與探究。

4 結論

以分離自敦煌地區(qū)鹽堿土壤中21株芽孢桿菌為研究對象，黃芪根腐病病原菌Fusarium solaniunKR997532為靶標菌，篩選得到較強拮抗作用的生防芽孢桿菌7-2-1-6，將其鑒定為枯草芽孢桿菌（B.subtilis），盆栽防效測定試驗結果顯示，菌株7-2-1-6對黃芪根腐病具有良好的防治作用。