真菌漆酶的性質(zhì)、生產(chǎn)、純化及固定化研究進(jìn)展

吳怡 馬鴻飛 曹永佳 司靜 崔寶凱

（北京林業(yè)大學(xué)生態(tài)與自然保護(hù)學(xué)院，北京 100083）

近年來(lái)，酶在工業(yè)應(yīng)用中占據(jù)了極其重要的位置，漆酶就是其中之一。漆酶（Laccase，EC1.10.3.2）是多酚氧化酶中一種含銅的糖蛋白氧化酶，與植物抗壞血酸氧化酶和哺乳動(dòng)物血漿銅藍(lán)蛋白同屬藍(lán)色多銅氧化酶家族，是研究最早最多的酶系統(tǒng)之一［1]。1883年，日本學(xué)者吉田首次在日本紫膠漆樹(shù)（Rhus verniciflua）漆液中發(fā)現(xiàn)了一種可以使汁液氧化變硬、催化漆固化過(guò)程的蛋白質(zhì)［2]，1894年Bertrand等［3]將這種蛋白質(zhì)命名為漆酶。

漆酶按其來(lái)源可分為植物漆酶、動(dòng)物漆酶和微生物漆酶3類。目前，已發(fā)現(xiàn)漆樹(shù)、木蠟樹(shù)、羅漢松、巴勒斯坦黃連木、七葉樹(shù)及連翹等樹(shù)種中均有漆酶存在，在水稻、棉花、茶、煙草等農(nóng)作物，芒果、香蕉、葡萄等水果中也發(fā)現(xiàn)了漆酶［4]。不同來(lái)源的漆酶，其性質(zhì)存在顯著差異。即使同屬漆樹(shù)漆酶，產(chǎn)于中國(guó)、日本的漆樹(shù)（Rhus vernicifera）酶和產(chǎn)于越南的漆樹(shù)（Rhus succedanea）酶在生物學(xué)性質(zhì)上也有很大差別。一直以來(lái)，關(guān)于動(dòng)物漆酶的研究都相對(duì)較少，僅在麻蠅、煙草天蛾、綠頭蒼蠅、蚊子和蝗蟲(chóng)等昆蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)有微量的漆酶活性［5-6]。有學(xué)者猜測(cè)，動(dòng)物中的漆酶可能并不是準(zhǔn)確意義上的漆酶，而是某些具有類似催化性能的多酚氧化酶，因此還需進(jìn)一步研究確定［7]。

微生物漆酶在自然界中分布最為廣泛，在大量落葉覆蓋的林區(qū)土壤中、造紙廠的木質(zhì)纖維廢水及水稻等作物的根部均有發(fā)現(xiàn)，按其來(lái)源可分為真菌漆酶和細(xì)菌漆酶［8-16]。其中真菌漆酶是自然界中漆酶的主要來(lái)源，具有單電子氧化還原電位高、催化活性強(qiáng)等特性，同時(shí)，真菌漆酶不僅能催化底物的氧化聚合反應(yīng)還能對(duì)木質(zhì)素進(jìn)行氧化轉(zhuǎn)化，具有十分廣闊的應(yīng)用前景和非常重要的研究?jī)r(jià)值。目前，該類漆酶的研究涉及到60多種真菌，主要以擔(dān)子菌和子囊菌為主，其中擔(dān)子菌中的白腐真菌是唯一能夠利用自身氧化酶系統(tǒng)將木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為二氧化碳的一類真菌［17]，被認(rèn)為是主要的真菌漆酶生產(chǎn)者和研究對(duì)象。

漆酶能夠利用分子氧為電子受體催化氧化6大類250余種底物，包括酚及其衍生物、羧酸及其衍生物、芳胺及其衍生物、金屬化合物和其他非酚類底物等［18-19]。在過(guò)去的幾十年中，由于其良好的催化氧化能力及對(duì)復(fù)雜環(huán)境污染物的降解能力而受到了研究者的極大關(guān)注，使得漆酶被廣泛應(yīng)用于紙漿漂白、環(huán)境治理、生物檢測(cè)、食品加工、有機(jī)合成以及生物能源等多個(gè)領(lǐng)域［20-24]。本文對(duì)近年來(lái)真菌漆酶的生物學(xué)性質(zhì)、生產(chǎn)、純化及固定化等方面的最新研究進(jìn)展進(jìn)行概述，以期為該領(lǐng)域的研究提供參考。

1 真菌漆酶的生物學(xué)性質(zhì)

1.1 結(jié)構(gòu)特征

漆酶結(jié)構(gòu)中最重要的部分就是銅原子，其參與漆酶活性中心的架構(gòu)和組成，結(jié)合底物并直接參與鍵的斷裂與形成，決定漆酶的活力和特異性，使漆酶具有氧化還原功能。典型的漆酶有4個(gè)銅原子及3個(gè)銅原子結(jié)合位點(diǎn)，根據(jù)磁學(xué)和光譜學(xué)性質(zhì)不同可將4個(gè)銅原子分為3類［25]。T1銅原子相對(duì)獨(dú)立，與兩個(gè)組氨酸（His）的N和一個(gè)半胱氨酸（Cys）的S配位，形成扭曲的四面體結(jié)構(gòu)。其中共價(jià)鍵Cu-S（Cys）的配位是還原態(tài)底物的結(jié)合位點(diǎn)，漆酶在此附近接受來(lái)自底物的電子轉(zhuǎn)移，進(jìn)而將底物徹底氧化，使得T1銅原子在614 nm（ε = 5 300 M-1cm-1）處產(chǎn)生強(qiáng)烈的藍(lán)色特征吸收帶［26]，因此也稱漆酶為銅藍(lán)蛋白。T2銅原子無(wú)特殊吸收峰，具有電子順磁共振效應(yīng)（Electron paramagnetic resonance，EPR）性質(zhì)，其與T3銅原子緊密相連形成一個(gè)三核中心，是漆酶的催化活性中心。該三核中心與8個(gè)His配位結(jié)合，其中T2銅原子結(jié)合2個(gè)His，T3銅原子結(jié)合6個(gè)His。T3銅原子由兩個(gè)銅原子組成，由于其偶聯(lián)作用導(dǎo)致T3銅原子的EPR性質(zhì)消失，但在330 nm處有寬的吸收峰［27]。同時(shí)，由于一些反應(yīng)中間體如過(guò)氧中間體的吸收，導(dǎo)致T3銅原子在400/420-460 nm之間也存在一些小的吸收帶［28]。圖1顯示了漆酶具體的活性中心結(jié)構(gòu)。

圖1 漆酶的活性中心結(jié)構(gòu)［29]

1.2 催化作用

漆酶作為一種氧化酶，其作用底物十分廣泛，能催化氧化木質(zhì)素、酚類化合物、非酚類化合物等多種物質(zhì)。簡(jiǎn)單而言，漆酶的催化氧化作用機(jī)理主要表現(xiàn)在底物自由基中間體的產(chǎn)生和分子氧還原成水兩個(gè)方面［29]。首先，反應(yīng)底物與處于酶活性中心的T1銅原子位點(diǎn)相結(jié)合，T1銅原子接受來(lái)自還原態(tài)底物的電子轉(zhuǎn)移，同時(shí)該底物被氧化形成自由基；其次，T1銅原子將單個(gè)電子通過(guò)Cys-His途徑傳遞到由T2和T3銅原子構(gòu)成的三核中心上，分子氧在此處接受電子，被還原成水。

由于漆酶的分子量較大，很難進(jìn)入細(xì)胞間隙，且氧化還原電勢(shì)大多在0.5-0.8 V之間，而非酚型芳香族化合物的氧化還原電勢(shì)在1.5 V左右，這使得漆酶不能夠直接氧化非酚型芳香族化合物［30]。介體是能夠被漆酶高效氧化的低分子量有機(jī)化合物，它能夠進(jìn)入細(xì)胞間隙，通過(guò)氧化作用形成的中間產(chǎn)物而高效氧化該介體介導(dǎo)的底物，且氧化態(tài)產(chǎn)物不對(duì)漆酶起抑制作用，還可以被二級(jí)底物還原，實(shí)現(xiàn)反復(fù)利用。漆酶對(duì)非酚型芳香族化合物的催化氧化大多是依靠介體完成的，因此，尋找天然、有效、廉價(jià)的介體是目前漆酶應(yīng)用的一個(gè)研究熱點(diǎn)。

1.3 理化性質(zhì)

1.3.1 溫度 真菌漆酶是一種適宜在溫和環(huán)境條件下發(fā)揮作用的氧化酶。其反應(yīng)的最適溫度范圍較窄，通常在25-50℃之間。過(guò)高或過(guò)低的溫度都會(huì)抑制漆酶活性，尤其是高溫，對(duì)漆酶活力的破壞比較嚴(yán)重。但不同來(lái)源的漆酶反應(yīng)最適溫度也存在顯著差異。據(jù)報(bào)道，從廣州地區(qū)分離的木霉（Trichoderma）中得到的漆酶具有耐高溫特性，這可能是由于其所處的地理環(huán)境所致，其最適反應(yīng)溫度為65℃，在70℃保溫60 min后殘余酶活保留60%以上［31]。漆酶的重組也可能使其最適溫度發(fā)生變化，葛飛等［32]通過(guò)響應(yīng)面法測(cè)得刺芹側(cè)耳（Pleurotus eryngii）所產(chǎn)漆酶的最適溫度為27.6℃，而夏文靜等［33]對(duì)P.eryngii漆酶進(jìn)行了重組，發(fā)現(xiàn)該重組酶在20-60℃范圍內(nèi)隨溫度增加漆酶的活性不斷升高，最適溫度為60℃。

1.3.2 pH 真菌漆酶的最適反應(yīng)pH通常為3.5-6.0［34]，如云芝栓孔菌（Trametes versicolor）所產(chǎn)漆酶的最適 pH 為 3.8［35]，多孔菌（Polyporus）為 4.2［36]，硬毛粗蓋孔菌（Funalia trogii）為 6.0［37]。在漆酶的生產(chǎn)過(guò)程中，最適pH的確定不僅要保證漆酶的高活性，還要考慮漆酶的穩(wěn)定性，如白腐真菌糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus）所產(chǎn)漆酶在pH為3.0的高酸性環(huán)境下活性較強(qiáng)，但漆酶穩(wěn)定性保持效果較差，而pH呈中性至堿性時(shí)，漆酶穩(wěn)定性較強(qiáng)但活性非常低，綜合考慮，該漆酶最佳反應(yīng)pH為5.0［38]。此外，研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)改變漆酶的pH可以使其作用發(fā)生變化，張楠等［39]發(fā)現(xiàn)漆酶對(duì)玉米秸稈木質(zhì)素同時(shí)兼具解聚和聚合作用，pH較高時(shí)綜合表現(xiàn)為解聚作用，pH較低時(shí)則表現(xiàn)為聚合作用。

1.3.3 金屬離子 多種金屬離子如K+、Ag+、Cu2+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Pb2+、Pd2+、Hg2+、Co2+、Ba2+、Fe2+和Fe3+等對(duì)漆酶活性也可產(chǎn)生重要的影響。一般而言，一定濃度的Cu2+會(huì)促進(jìn)漆酶活性的增加。Zhuo等［40]研究了幾種金屬離子對(duì)P. ostreatusHAUCC 162漆酶活性的影響，10 d后發(fā)現(xiàn)Cu2+、Fe2+、Mn2+、Cd2+均使胞外漆酶活性有所增加，其中Cu2+效果最為顯著。也有一些金屬離子對(duì)漆酶活性產(chǎn)生抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，Co2+、Ni2+、Cd2+、Fe3+、Ag+等對(duì)漆酶活性的抑制作用很強(qiáng)，其原因可能是反應(yīng)過(guò)程中，這些金屬離子占據(jù)了漆酶的活性中心，改變了漆酶的結(jié)構(gòu)，使底物不能與漆酶相結(jié)合，從而抑制了酶活［41]。也有報(bào)道稱，Co2+、Mn2+、Ca2+、Fe2+和Hg2+會(huì)使雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）漆酶活性下降，其中Hg2+對(duì)其酶活顯示出了較強(qiáng)的抑制作用［42]。此外，部分金屬離子對(duì)漆酶降解染料的能力會(huì)產(chǎn)生促進(jìn)作用，Cu2+和Cr6+使從白腐真菌歐洲靈芝（Ganoderma lucidum）中獲得的漆酶對(duì)濃度為50.0 mg/L的兩種染料雷瑪唑黑5（Remazol Black 5，RB5）和雷瑪唑亮藍(lán)R（Remazol brilliant blue R，RBBR）的脫色效果顯著增強(qiáng)，其中1.0 mmol/L Cu2+的添加使漆酶在1 h內(nèi)對(duì)RB5和RBBR的脫色率分別達(dá)到94% 和 35.5%［43]。

2 真菌漆酶的生產(chǎn)

2.1 漆酶高產(chǎn)菌株的篩選

真菌漆酶在紙漿漂白、環(huán)境治理、生物檢測(cè)、食品加工、有機(jī)合成以及生物能源等多個(gè)工業(yè)領(lǐng)域具有較高的應(yīng)用價(jià)值及潛力［44-51]，但不同真菌產(chǎn)漆酶的能力不同，因此，篩選高產(chǎn)漆酶的真菌菌株就顯得尤其重要，這將為漆酶高產(chǎn)菌株的選育和工業(yè)等領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)［52]。目前，高產(chǎn)漆酶的真菌菌株主要集中于小薄孔菌屬（Antrodiella）、黑木耳（Auricularia heimuer）、毛木耳（Auricularia polytricha）、黑管孔菌屬（Bjerkandera）、蠟孔菌屬（Ceriporia）、擬蠟孔菌屬（Ceriporiopsis）、齒毛菌屬（Cerrena）、金針菇（Flammulina velutipes）、木蹄層孔菌（Fomes fomentarius）、粗蓋孔菌屬（Funalia）、靈 芝 屬（Ganoderma）、 深 褐 褶 菌（Gloeophyllum sepiarium）、灰樹(shù)花孔菌（Grifola frondosa）、猴頭菌屬（Hericium）、纖孔菌屬（Inonotus）、囊耙齒菌屬（Irpex）、榮氏孔菌屬（Junghuhnia）、香菇（Lentinus edodes）、巨孔菌屬（Megasporia）、銳孔菌屬（Oxyporus）、多年臥孔菌屬（Perenniporia）、木層孔菌屬（Phellinus）、側(cè)耳屬（Pleurotus）、Polyporus、鮮紅密孔菌（Pycnoporus cinnabarinus）、血紅密孔菌（Pycnoporus sanguineus）、硬孔菌屬（Rigidoporus）、桑黃屬（Sanghuangporus）、裂褶菌（Schizophyllum commune）和栓孔菌屬（Trametes）等［34，53-54]。真菌漆酶的篩選主要是通過(guò)愈創(chuàng)木酚平板法初篩和液體發(fā)酵復(fù)篩。其中，愈創(chuàng)木酚能夠被漆酶氧化產(chǎn)生茶褐色物質(zhì)，進(jìn)而利用氧化變色圈與菌絲直徑的比值初步判斷是否有漆酶產(chǎn)生［55]。劉家揚(yáng)等［56]在干枯的木頭中通過(guò)愈創(chuàng)木酚PDA平板法初篩得到6株產(chǎn)漆酶活力較高的菌株。除愈創(chuàng)木酚法外，陳瓊?cè)A等［57]還通過(guò)α-萘酚的PDA平板法對(duì)43株大型真菌進(jìn)行篩選，通過(guò)12 d對(duì)菌株生長(zhǎng)狀況的觀察及菌絲圈與紫色氧化圈直徑的測(cè)量，篩選出21株氧化圈直徑與菌絲圈直徑比值較大的菌株，具有較高的漆酶活性。

液體發(fā)酵復(fù)篩法通常是對(duì)菌株進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)后，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)420 nm波長(zhǎng)處吸光度的變化。王玉俊等［58]用液體發(fā)酵復(fù)篩的方法對(duì)P.cinnabarinus、F. fomentarius、一色齒毛菌（Cerrena unicolor）、輪紋韌革菌（Stereum ostrea）和寬鱗多孔菌（Polyporus squamosus）5種白腐真菌的產(chǎn)漆酶能力進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)P. cinnabarinus所產(chǎn)漆酶活性最高。

2.2 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)條件的選擇是真菌發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的關(guān)鍵一環(huán)，可以通過(guò)單因子和正交實(shí)驗(yàn)或響應(yīng)面設(shè)計(jì)的方法確定真菌產(chǎn)漆酶的最佳培養(yǎng)基及條件，主要涉及到碳源、氮源、溫度、pH、轉(zhuǎn)速等因素［59]。一般來(lái)說(shuō)，真菌生產(chǎn)漆酶的最適溫度為25-35℃，轉(zhuǎn)速為140-200 r/min，偏酸性條件會(huì)促進(jìn)真菌的發(fā)酵，在氮源相對(duì)較少時(shí)形成的“氮饑餓”狀態(tài)會(huì)使漆酶的產(chǎn)量增加。王書(shū)超等［60]以樹(shù)舌靈芝（Ganoderma applanatum）為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和Plackett-Burman設(shè)計(jì)對(duì)漆酶的生產(chǎn)條件進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)由20 g/L玉米粉和5 g/L豆粕組成、pH為5.5的培養(yǎng)基中，28℃搖瓶培養(yǎng)7 d時(shí)漆酶活性最高。鄭飛等［61]將白腐真菌東方栓孔菌（Trametes orientalis）接種在兩種營(yíng)養(yǎng)條件不同的液體培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)該菌在缺營(yíng)養(yǎng)條件下對(duì)部分次級(jí)代謝產(chǎn)物的分泌能力較強(qiáng)，且具有較好的適應(yīng)能力，而在復(fù)雜的培養(yǎng)基中生產(chǎn)漆酶水平較高。

此外，發(fā)酵罐法通過(guò)旋轉(zhuǎn)攪拌增加了氧氣含量，使培養(yǎng)基得到充足的養(yǎng)分，通氣效果較好，解決了搖瓶培養(yǎng)中菌液不均勻等問(wèn)題，受到了研究者的極大關(guān)注［62]。近年來(lái)，對(duì)發(fā)酵罐生產(chǎn)漆酶的研究越來(lái)越多，其中包括黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）、韋伯靈芝（Ganoderma weberianum）、疣孢漆斑菌（Myrothecium verrucaria）等。陳瓊?cè)A等［63]將G. weberianum漆酶置于50 L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，漆酶活性達(dá)到27 667.7 U/L，是搖瓶發(fā)酵水平的2.5倍。然而，發(fā)酵罐法使用成本較高，對(duì)于實(shí)驗(yàn)是否需要發(fā)酵罐及對(duì)發(fā)酵罐大小的選擇要綜合考慮，對(duì)于發(fā)酵罐未來(lái)是否會(huì)達(dá)到普遍使用的狀態(tài)還有待觀察。

2.3 漆酶的誘導(dǎo)生產(chǎn)

在真菌培養(yǎng)過(guò)程中適當(dāng)添加誘導(dǎo)劑可以大大提高漆酶的產(chǎn)量和活性。誘導(dǎo)劑的種類多樣，可以分為化學(xué)誘導(dǎo)劑、生物誘導(dǎo)劑和物理誘導(dǎo)劑等?；瘜W(xué)誘導(dǎo)劑主要是愈創(chuàng)木酚、金屬離子、芳香族化合物、酚類化合物等，其中銅和阿魏酸是G. lucidum產(chǎn)漆酶最好的誘導(dǎo)劑［64]，金屬離子（Fe2+、Cu2+）與芳香族化合物（香草酸、肉桂酸和阿魏酸）的協(xié)同刺激使P. ostreatus產(chǎn)漆酶的能力進(jìn)一步提升［40]。同一類誘導(dǎo)劑的復(fù)合誘導(dǎo)作用通常比使用單一誘導(dǎo)劑效果要好，不同類誘導(dǎo)劑間的協(xié)同作用也會(huì)是提高漆酶產(chǎn)量和活性的有效誘導(dǎo)方法［65]。目前研究的生物誘導(dǎo)劑主要包括木屑、玉米芯、棉籽殼、麥麩、麥稈等。安琪等［66]在富含簡(jiǎn)單碳/氮源的培養(yǎng)基中添加堿性木質(zhì)素作為生物誘導(dǎo)劑，使P. ostreatus的菌絲生物量和漆酶活性均有顯著提高。Couto等［67]在對(duì)半固態(tài)條件下T. versicolor產(chǎn)漆酶能力的研究中發(fā)現(xiàn)，二甲苯胺是最好的誘導(dǎo)劑，可以使漆酶活性達(dá)到1 700 U/L，但是在以大麥麩為基質(zhì)的情況下，能夠使T. versicolor所產(chǎn)的漆酶活性進(jìn)一步提高，達(dá)到2 000 U/L。與生物和化學(xué)誘導(dǎo)方法相比，物理誘導(dǎo)并不常見(jiàn)，主要是通過(guò)紫外處理、超高壓處理、輻射處理等方式。研究發(fā)現(xiàn)，使用紫外誘導(dǎo)的方法處理G. lucidum，所產(chǎn)漆酶活力是未處理菌株的2.83倍，發(fā)酵時(shí)間也縮短了1 d［68]。

3 真菌漆酶的純化

漆酶是一種酶蛋白，常常與其它物質(zhì)復(fù)雜地混合在一起，在實(shí)際的工業(yè)流程中，對(duì)漆酶適應(yīng)極端環(huán)境的要求極高，因此開(kāi)發(fā)和研究具有特殊性質(zhì)的酶蛋白，對(duì)于工業(yè)化發(fā)展尤為重要［69]。而工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中往往需要更加耐高溫和耐酸堿性的抗性酶，為評(píng)估漆酶在工業(yè)應(yīng)用中的適合度，需要對(duì)其理化性質(zhì)、作用機(jī)理和生物學(xué)功能進(jìn)行深入地研究和測(cè)定，因此，漆酶的分離純化和性質(zhì)分析已經(jīng)成為漆酶研究的重點(diǎn)［70]。據(jù)報(bào)道，胞外酶是真菌漆酶的主要種類，與胞內(nèi)酶相比，其提取分離純化的過(guò)程更加簡(jiǎn)單容易，且穩(wěn)定性也較好，可適于多種工業(yè)應(yīng)用［34]。截至目前，全世界被純化和分析性質(zhì)的真菌漆酶已經(jīng)有上百種［71]。

漆酶的分離純化方法有透析、超濾、電泳、等電點(diǎn)沉淀、鹽析、離子交換柱層析、親和層析和疏水層析等，通常需要采用幾種方法相結(jié)合才能將漆酶從復(fù)雜的體系中分離出來(lái)。Ramírez-Cavazos等［70]對(duì)P. sanguineusCS43的兩種熱穩(wěn)定性漆酶通過(guò)超濾、離子交換柱層析和疏水作用層析進(jìn)行純化，得到其比活力近285 U/mg。他們還發(fā)現(xiàn)這兩種漆酶在50℃和60℃都顯示出很高的氨基酸序列相似性（91%）和熱穩(wěn)定性。性質(zhì)分析主要是研究其催化系數(shù)、最適pH、熱穩(wěn)定性、光譜性質(zhì)、分子量、底物特異性等，并探索金屬離子、螯合劑和無(wú)機(jī)化合物等對(duì)漆酶活性和穩(wěn)定性的影響。菌株來(lái)源不同的漆酶，其穩(wěn)定性、最適pH、最適溫度、分子量、作用底物及動(dòng)力學(xué)特征等都不盡相同［72]，使用不同的純化方法，漆酶的比活力和回收率也不盡相同。Manavalan等［73]用交聯(lián)葡聚糖G-100和DEAE-纖維素柱層析純化G.lucidum漆酶，獲得的漆酶分子量為38.3 kD，活性回收率為32%，以2，2'-連氮-雙（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）（2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）為底物、pH 5.0、溫度為55℃時(shí)，漆酶活性最高。而Wang等［74]以白腐真菌C. unicolorGSM-01中獲得的具有較強(qiáng)染料脫色能力的漆酶為材料，通過(guò)3個(gè)離子交換柱層析和一個(gè)凝膠過(guò)濾層析進(jìn)行純化，得到的漆酶是一種單體蛋白，分子量為63.2 kD，活性回收率為33.9%，最適pH和溫度分別為2.6和45℃。此外，還發(fā)現(xiàn)Fe3+和Fe2+是C. unicolorGSM-01漆酶最有效的抑制劑，Mn2+可低幅度提高3.8%-10.5%漆酶活性。Zheng等［75]從T.orientalis中發(fā)現(xiàn)了一種新型漆酶，并對(duì)其通過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀、DEAE-cellulose DE52陰離子交換柱層析和Sephrose CL-6B瓊脂糖凝膠柱層析進(jìn)行純化，發(fā)現(xiàn)得到的漆酶是一種單體蛋白質(zhì)，分子量為44.0 kD，回收率為47.33%，最佳pH和溫度分別為4.0和80℃，Mn2+對(duì)提高漆酶活性有較好的效果。

近年來(lái)，漆酶的純化方法更新變化不大，在今后的研究中，應(yīng)當(dāng)注重探索和開(kāi)發(fā)純化效率更高、操作更加簡(jiǎn)單易行的新型純化方法，為漆酶性質(zhì)的研究及進(jìn)一步工業(yè)化應(yīng)用提供技術(shù)支持。

4 真菌漆酶的固定化

漆酶是一類具有生物催化功能的蛋白質(zhì)，其能夠在溫和條件下高效地催化生物反應(yīng)，對(duì)作用底物的選擇具有專一性，且反應(yīng)后酶自身的數(shù)量和性質(zhì)不發(fā)生改變，具有無(wú)污染、環(huán)境友好等特點(diǎn)，符合當(dāng)今工業(yè)化生產(chǎn)的環(huán)保要求［76]。但游離的漆酶穩(wěn)定性差，在環(huán)境中易受溫度、pH、酸堿性等因素的影響，且不易分離提純進(jìn)行重復(fù)性使用，這在一定程度上限制了漆酶的工業(yè)化應(yīng)用。

1966年，Tosa等［77]通過(guò)固定化處理使氨基酰化酶在工業(yè)上實(shí)現(xiàn)了連續(xù)化生產(chǎn)，提高了酶的利用率，從此，酶的固定化研究激發(fā)了學(xué)者們的廣泛興趣。固定化酶是指利用物理或化學(xué)手段將酶固定在載體上或者束縛在一定范圍內(nèi)、同時(shí)保持了催化活性、并能連續(xù)反應(yīng)和反復(fù)使用的酶制劑［78]。將固定化技術(shù)應(yīng)用于漆酶，使其易從反應(yīng)體系中分離出來(lái)，實(shí)現(xiàn)了重復(fù)利用，同時(shí)可以簡(jiǎn)化產(chǎn)物的提純工藝，增強(qiáng)游離漆酶的化學(xué)穩(wěn)定性及對(duì)周圍環(huán)境的適應(yīng)能力，且保持了最初的催化特性和催化效率，大大提升了對(duì)酶反應(yīng)過(guò)程的操控范圍，為漆酶的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展和進(jìn)一步應(yīng)用開(kāi)拓了更廣闊的前景［79-88]。

目前，漆酶固定化的方法已經(jīng)相對(duì)成熟，常用的固定化方法可分為物理法和化學(xué)法，物理法包括吸附法和包埋法等，化學(xué)法包括共價(jià)法和交聯(lián)法等。固定化載體的選擇范圍相對(duì)較廣，研究人員也在不斷探索和發(fā)現(xiàn)新的固定化載體并將其應(yīng)用到漆酶的固定化中［89-91]，載體的選擇是漆酶能否實(shí)現(xiàn)固定化及固定化效果好壞的關(guān)鍵，表1總結(jié)了幾種載體的優(yōu)勢(shì)、固定化方法、固定化效果及應(yīng)用。

表1 幾種固定化載體的比較

近年來(lái)，有關(guān)磁性載體的研究越來(lái)越多，其能夠顯著提升漆酶的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性和貯存穩(wěn)定性，同時(shí)也增加了酶的回收率和可操作性［99]，但使用磁性載體固定的漆酶活性并不十分穩(wěn)定。因此，開(kāi)發(fā)優(yōu)良、穩(wěn)定的漆酶固定化載體將成為今后研究的熱點(diǎn)方向。除載體的選擇外，合適的固定化方法也是決定漆酶固定化效果的關(guān)鍵，適合的固定化方法結(jié)合高效、穩(wěn)定的載體將會(huì)使漆酶的使用效率顯著提升。然而，很多關(guān)于固定化漆酶的研究目前仍處于實(shí)驗(yàn)室階段，投入到工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)的案例少之又少，還需進(jìn)一步研究。

5 小結(jié)

漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，廣泛存在于各種真菌、植物和細(xì)菌中，真菌漆酶的研究最多也最深入。為提高真菌漆酶活性，進(jìn)行了大量生物學(xué)特性及優(yōu)化生產(chǎn)條件的相關(guān)研究，并取得了一些進(jìn)展。漆酶的生產(chǎn)是工業(yè)化應(yīng)用的基礎(chǔ)，發(fā)掘性質(zhì)優(yōu)良的漆酶并提高其活性，將是今后不斷研究的重點(diǎn)。

漆酶本質(zhì)上是一種環(huán)保型酵素，具有獨(dú)特的降解機(jī)理，對(duì)性質(zhì)優(yōu)良的漆酶進(jìn)行純化和固定化，提高其穩(wěn)定性和使用效率，實(shí)現(xiàn)多次重復(fù)利用，是目前研究的熱點(diǎn)方向。尋找適合的純化及固定化方法、穩(wěn)定及機(jī)械性能優(yōu)異的酶固定化載體將是漆酶今后實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵。