吉醫(yī)膠囊(SAOG)對CTX 致免疫低下小鼠的免疫增強作用

李正祎,王 月,王 瑤,于佳卉,張宸豪

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗學(xué)院,吉林 吉林132013;2.北華大學(xué)藥學(xué)院,吉林 吉林132013)

吉醫(yī)膠囊(暫用名)是基于中醫(yī)理論對免疫低下疾病的認(rèn)識,結(jié)合中藥理論組合而成的中藥復(fù)方,主要用于調(diào)節(jié)人的免疫功能。此復(fù)方中藥由北五味子、黃芪、麥冬、人參(Schisandra,Astragalus,Radix Ophiopogonis,Ginseng,SAOG),按原藥1∶5∶2∶1組成,北五味子、黃芪、麥冬提取多糖,人參提取皂苷。五味子藥食同源,多糖含量豐富,具有明顯的免疫調(diào)節(jié)作用[1]。黃芪是治療氣虛的常用中藥,有“補氣升陽之王”的美譽,大量研究報道了黃芪多糖對免疫功能的調(diào)節(jié)和增強作用,且涉及到特異性和非特異性免疫等諸多方面[2]。麥冬多糖為麥冬發(fā)揮增強免疫作用的有效部位,除藥用外,麥冬作為保健飲品和功能性食品也受到了國際保健食品界的青睞[3]。人參皂苷可作用于機(jī)體的免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫分子,提高機(jī)體非特異性免疫和特異性免疫功能[4]。

一定劑量的環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX)對機(jī)體免疫系統(tǒng)有一定損害,被廣泛應(yīng)用于建立動物免疫抑制模型[5]。本試驗根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范實施手冊(2003 版)》“增強免疫力功能評價方法”[6],采用CTX 制備免疫低下小鼠模型,觀察SAOG 對CTX 致小鼠免疫低下的保護(hù)作用及其增強免疫的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 SPF 級6~8 周齡,雄性ICR 小鼠,體質(zhì)量18~22 g,由長春億斯實驗動物技術(shù)有限公司提供,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(吉)2016-0003。

北五味子,購自吉林省集安市五味子種植基地;黃芪、麥冬和人參,購自安圖市安興中藥飲片有限公司;北五味子多糖、黃芪多糖、麥冬多糖,人參皂苷均由北華大學(xué)藥理教研室協(xié)助提取;IL-2 試劑盒、IFN-γ、TNF-α 試劑盒,均購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司;刀豆蛋白(ConA),購自美國Sigma公司;CCK-8,購自碧云天生物技術(shù)有限公司;CTX,購自江蘇盛迪藥業(yè)有限公司;印度墨汁,購自上海銳永生物科技有限公司;Annexin-v-FITC/PE 凋亡試劑盒,購自天津三箭生物技術(shù)有限公司;Na2CO3,購自廣州化學(xué)試劑廠。

Epics-XL 流式細(xì)胞儀,美國Beckman Coulter 公司;Infinite M200 酶標(biāo)儀,瑞士Tecan 公司;722N 可見分光光度計,上海精密儀器儀表有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 吉醫(yī)膠囊的制備 本文所用的北五味子多糖、黃芪多糖、麥冬多糖的提取方法為水提醇沉法。大致的制備過程如下:用蒸餾水回流提取2 次后,收集濾液;濃縮濾液,加入乙醇至酒精濃度為90%,過夜;收集沉淀,干燥即得。人參皂苷采用回流提取法提取[7]。將上述所得混勻制成膠囊,試驗用混合物保存在-20 ℃,用前生理鹽水溶解。

1.2.2 動物分組、造模及給藥 將動物隨機(jī)分為10 組,設(shè)對照組(Contral group,CON)、免疫抑制模型組(Model group,MOD)、吉醫(yī)膠囊低、中、高(SAOG-L、M、H)劑量組(劑量分別為0.4、0.8、1.6 mg/10 g·bw),每組各10 只小鼠。各組均按10 mL/kg·bw 灌胃給藥,每天1 次,連續(xù)21 d;對照組和免疫抑制模型組灌胃等體積生理鹽水。除對照組外,其他各組在給受試物第17 天開始腹腔注射環(huán)磷酰胺(20 mg/kg·bw·d),連續(xù)5 d,末次注射后24 h 采血并剖檢測定各項指標(biāo);ICR 鼠一半用于碳粒廓清試驗。

1.2.3 指標(biāo)測定

1.2.3.1 鼠外周血白細(xì)胞的測定 給藥第22 天(末次給予CTX 第1 天),小鼠摘眼球采血,EDTA抗凝,用手工法測定白細(xì)胞總數(shù)。方法:取小鼠鮮血10 μL 于490 μL 2%冰乙酸中,輕輕混勻,取1 滴于血球計數(shù)板上10 倍物鏡下計數(shù)。

1.2.3.2 SAOG 對小鼠免疫器官重量的影響 稱量各組小鼠體質(zhì)量,脫頸椎處死小鼠。取其胸腺和脾臟,剪去脂肪和筋膜組織稱量胸腺和脾臟質(zhì)量,計算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(mg)/體重(g)。隨后,用10%福爾馬林溶液固定胸腺和脾臟,將病理標(biāo)本切片用H.E.染色。在光學(xué)顯微鏡下(放大倍數(shù)為400 倍)觀察病理變化。

1.2.3.3 脾淋巴細(xì)胞凋亡檢測 無菌條件下剝離脾臟,分別碾碎,置于200 目過濾網(wǎng)過濾,棄去細(xì)胞碎片,制成脾細(xì)胞懸液。 PBS 清洗2 次,用1×Binding Buffer 調(diào)節(jié)細(xì)胞至106~107個/mL,取細(xì)胞100 μL 于流式 管 中,加10 μL Annexin-VFITC 冰上混勻,避光15 min,再加1×Binding Buffer 380 μL,再加10 μL PI,進(jìn)行流式細(xì)胞儀(FCM)檢測。

1.2.3.4 脾淋巴細(xì)胞增殖檢測 將上述試驗中部分單細(xì)胞脾臟懸液濃度調(diào)整為2×106/mL。每份懸液分2 孔加入24 孔培養(yǎng)板中,每孔1 mL,其中一孔加50 μL(5 μg/mL),另一孔不加ConA 作為對照。孵育72 h,每孔加入40 μL CCK-8 后4 h 用450 nm 波長檢測,計算脾淋巴細(xì)胞增殖率。淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力=加入ConA 孔的A 值-不加入ConA 孔的A 值。

1.2.3.5 血清IL-2、IFN-γ、TNF-α 水平檢測 將小鼠摘除眼球取血后,離心取上清液。采用ELISA 法檢測各組小鼠血清IL-2、IFN-γ、TNF-α 水平,具體操作根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。采用全波長酶標(biāo)儀檢測450 nm 波長處OD 值,繪制標(biāo)準(zhǔn)化曲線。

1.2.3.6 小鼠碳廓清試驗 從小鼠尾靜脈注入50%稀釋的印度墨汁,按每10 g 體質(zhì)量0.1 mL 計算。待墨汁注入,立即計時。測定注入墨汁后3(A3)、11 min(A11),分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20 μL,并立即將其加到2 mL 0.1%Na2CO3溶液中。用分光光度計或全自動酶標(biāo)儀在600 nm 波長處測光密度A 值,以Na2CO3溶液作空白對照。將小鼠處死,取肝臟和脾臟,用濾紙吸干臟器表面血污,稱量質(zhì)量。以吞噬指數(shù)表示小鼠碳廓清的能力。按下式計算吞噬指數(shù)α。

α=體質(zhì)量/(肝質(zhì)量+脾質(zhì)量)×K1/3

K=(LogA3-LogA11)/(t11-t3)

1.3 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理,所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±準(zhǔn)差(X±s)表示。經(jīng)t 檢驗,P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義;P<0.01 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 SAOG 對小鼠臟器指數(shù)的影響 由表1 可知,在腹腔注射CTX 之后,最終體重模型組與空白組相比小鼠的體重出現(xiàn)很大程度的降低,表明該模型是成功的;與模型組比較,對照組、SAOG-L/M 組小鼠體質(zhì)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),對照組、SAOG-L/M 組小鼠之間體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);SAOG-H 組與模型組比較小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與對照組相比,模型組的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均有明顯的降低,CTX引起小鼠免疫器官萎縮,造成嚴(yán)重的免疫抑制,表明造模是成功的。與模型組相比,不同劑量SAOG對胸腺、脾臟均有明顯的恢復(fù)作用(P<0.05),均可以大幅度提高小鼠的胸腺/脾臟指數(shù)。因此,SAOG對CTX 造成的免疫器官抑制有一定的恢復(fù)作用,而且以低劑量對胸腺和脾臟的恢復(fù)作用更明顯,但不同劑量組之間的差異并不明顯。

2.2 SAOG 對小鼠白細(xì)胞總數(shù)的影響 小鼠白細(xì)胞正常范圍為(4~12)×109個/L[8]。由圖1 可知,模型組小鼠的白細(xì)胞個數(shù)明顯低于正常范圍。各SAOG 組的白細(xì)胞總數(shù)較模型組都有明顯增長(P<0.05),但不同劑量SAOG 組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 SAOG 對小鼠臟器指數(shù)的影響

圖1 SAOG 對小鼠白細(xì)胞總數(shù)的影響

2.3 SAOG 對CTX 致免疫低下小鼠脾臟淋巴細(xì)胞凋亡的影響 不同劑量組的SAOG 對CTX 致免疫低下小鼠脾淋巴細(xì)胞凋亡的影響如圖2 所示,結(jié)果表明,與對照組相比,模型組早期凋亡率、晚期凋亡率及總凋亡率均顯著增加(P<0.01);與模型組相比SAOG中、高劑量組的早期凋亡率、晚期凋亡率及總凋亡率均顯著下降(P<0.01),低劑量組的早期凋亡率、晚期凋亡率及總凋亡率呈明顯下降(P<0.05)。

2.4 SAOG 對CTX 致免疫低下小鼠T 淋巴細(xì)胞增殖能力的影響 結(jié)果用加入和不加ConA 的光密度值的差值來表示脾臟淋巴細(xì)胞的增殖能力。若差值越大,則表示增殖能力越強。SAOG 對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響如表2 所示,結(jié)果表明,各試驗組小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化值(ConA+與ConA-吸光度差值)均高于模型組,且存在劑量-反應(yīng)關(guān)系,隨SAOG 劑量的增加呈上升趨勢。

2.5 SAOG 對CTX 致免疫低下小鼠碳廓清試驗的影響 結(jié)果如圖3 所示,與對照組比較,模型組吞噬指數(shù)α 顯著降低(P<0.01)。與模型組比較,SAOG高劑量組吞噬指數(shù)α 明顯升高(P<0.05)。SAOG低/中劑量組吞噬指數(shù)α 雖與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)差異,但呈上升趨勢。

圖2 SAOG 對小鼠脾淋巴細(xì)胞凋亡的影響

表2 混合物對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力的影響

2.6 SAOG 對CTX 致免疫低下小鼠血清中細(xì)胞因子的影響 如圖4 所示,通過ELISA 法檢測血清IL-2、IFN-γ、TNF-α 濃度,與對照組相比模型組IL-2、TNF-α、IFN-γ 濃度均明顯降低(P<0.05);與模型組比較,SAOG-H 組IL-2 濃度明顯增高(P<0.05)。SAOG-M/H 組TNF-α,SAOG-H 組IFN-γ 濃度明顯增高(P<0.05)。

2.7 SAOG 對CTX 致免疫低下小鼠脾、胸腺病理形態(tài)學(xué)的影響 為進(jìn)一步了解SAOG 對CTX 致免疫低下小鼠免疫器官的影響作用,行脾、胸腺組織形態(tài)學(xué)觀察,組間比較結(jié)果如下:如中插彩版圖5、圖6脾組織切片所示:對照組小鼠脾組織脾小體形態(tài)和數(shù)量正常,白髓區(qū)界限較清晰,白髓區(qū)的淋巴細(xì)胞排列致密,淋巴濾泡結(jié)構(gòu)清晰可見;紅髓區(qū)富含充有紅細(xì)胞的血竇。模型組脾組織脾小體數(shù)量明顯減少,體積明顯減小,呈萎縮狀態(tài),紅髓和白髓分界不清。SAOG-L 組脾組織白髓區(qū)淋巴細(xì)胞數(shù)量未見明顯減少,脾小體數(shù)量略有減少。SAOG-M/H 組脾組織紅髓和白髓界限分明,皮質(zhì)形態(tài)大小接近正常,未見有明顯的病理學(xué)損傷。

圖3 SAOG 對小鼠吞噬指數(shù)α 的影響

對照組胸腺內(nèi)可見小葉內(nèi)梁,胸腺皮質(zhì)大小形態(tài)正常,每個皮質(zhì)內(nèi)可見髓質(zhì),髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰。與對照組相比,模型組胸腺皮質(zhì)淋巴細(xì)胞減少,未聚集成結(jié)節(jié)狀,髓質(zhì)與皮質(zhì)分界不清,髓質(zhì)數(shù)量減少。與模型組相比,SAOG-H 組和SAOG-M 組皮質(zhì)與髓質(zhì)分界清晰,皮質(zhì)形態(tài)大小恢復(fù)正常,SAOG-L 組皮層和髓質(zhì)分界不清晰,但略好于模型組。

3 討論

圖4 血清IL-2、IFN-γ、TNF-α 濃度檢測

本試驗通過連續(xù)5 d 腹腔注射CTX(20 mg/kg·bw)建立免疫抑制模型,研究吉醫(yī)膠囊(SAOG)對免疫抑制小鼠各個免疫指標(biāo)的調(diào)節(jié)效應(yīng)。單獨將模型組與空白組相比可以發(fā)現(xiàn),模型組的體重、免疫器官指數(shù)、外周血白細(xì)胞數(shù)、巨噬細(xì)胞的吞噬能力、細(xì)胞因子水平等均存在顯著差異,說明免疫抑制模型造模較成功。而與模型組相比,SAOG 能夠?qū)TX致免疫低下組小鼠的體重、免疫器官指數(shù)、外周血白細(xì)胞數(shù)、巨噬細(xì)胞的吞噬能力、細(xì)胞因子等免疫指標(biāo)恢復(fù)到接近正常水平。這些數(shù)據(jù)說明,SAOG對免疫抑制小鼠的免疫功能具有恢復(fù)作用。

圖5 各組小鼠脾組織H.E.染色結(jié)果 (×400)

圖6 各組小鼠胸腺組織H.E.染色結(jié)果 (×400)

非特異性免疫是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分,單核-巨噬細(xì)胞能對外來異物進(jìn)行識別和清除,單核巨噬細(xì)胞的吞噬能力是衡量機(jī)體非特異性免疫功能的標(biāo)志之一,吞噬率可以反映機(jī)體非特異性免疫功能的強弱[9]。本試驗結(jié)果表明,SAOG 能促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力,尤以SAOG-L 組增加明顯,具有統(tǒng)計學(xué)意義,提示SAOG 能顯著增強小鼠非特異性免疫功能。胸腺和脾臟是重要的免疫器官,其臟器指數(shù)可以在一定程度上反應(yīng)機(jī)體免疫功能的強弱。試驗組胸腺、脾臟與模型相比質(zhì)量均增大,并隨劑量增大作用增強,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05 或P<0.01),表明SAOG 能夠促進(jìn)小鼠胸腺、脾臟細(xì)胞的增殖,增加小鼠抗體生成器官脾臟及胸腺的重量,提高小鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)。脾淋巴細(xì)胞增殖試驗結(jié)果表明,SAOG 各組OD450值均較模型組顯著增高(P<0.05 或P<0.01),表明SAOG 能促進(jìn)小鼠T 淋巴細(xì)胞的增殖,提示SAOG 可作用于免疫細(xì)胞而增強細(xì)胞免疫功能,但各劑量組在試驗所用濃度值時相比無統(tǒng)計學(xué)差異、試驗結(jié)果無規(guī)律改變。

細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ 和TNF-α 在機(jī)體免疫細(xì)胞活化過程中起促進(jìn)作用。本試驗結(jié)果還表明,SAOG 能顯著提高免疫低下小鼠外周血免疫細(xì)胞分泌的IL-2、IFN-γ 和TNF-α 等細(xì)胞因子,對免疫反應(yīng)起正調(diào)節(jié)作用。根據(jù)試驗結(jié)果,SAOG 可以正向調(diào)節(jié)CTX 致免疫低下小鼠的機(jī)體免疫功能,這一功能可能源自其對T 淋巴細(xì)胞的分化成熟的調(diào)節(jié)作用。該作用不僅能夠提升小鼠細(xì)胞免疫的總體水平,還可促進(jìn)免疫細(xì)胞分泌各種淋巴因子。

脾臟是人體最大的淋巴器官,本實驗選取小鼠的脾臟作為研究對象,通過測定CTX 致免疫低下小鼠的脾淋巴細(xì)胞凋亡情況,間接的反映出SAOG 對免疫低下小鼠脾臟功能的影響。試驗結(jié)果表明,與模型組相比,SAOG 三個不同劑量組均能抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞凋亡,且高劑量組的效果最為明顯。

病理學(xué)檢查可以從不同水平上反映臟器、組織的健康狀態(tài)。本試驗組織病理學(xué)檢查結(jié)果表明,給藥SAOG 后不同劑量組脾、胸腺組織有不同程度的恢復(fù),組織結(jié)構(gòu)變清晰,淋巴細(xì)胞數(shù)量增多,以中/高劑量組效果好。據(jù)文獻(xiàn)報道,中藥多糖對受損傷的免疫器官有較好的保護(hù)和調(diào)節(jié)作用[10],而SAOG中五味子、黃芪、麥冬中含有大量多糖,可能是發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的主要成分。同時人參皂苷可作用于機(jī)體的免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫分子,提高機(jī)體非特異性免疫和特異性免疫功能[5]。

綜上所述,吉醫(yī)膠囊(SAOG)能顯著增強小鼠免疫功能,很有開發(fā)前景,是有效的能增強免疫功能的組合方。