荷斯坦奶牛瓜氨酸血癥PCR-DHPLC 檢測(cè)方法建立與應(yīng)用

辛學(xué)謙,鄭小龍,張曉文,王 群,姜 帆,孫 濤,梁成珠,岳志芹

(青島海關(guān)技術(shù)中心,山東 青島266002)

瓜氨酸血癥(Citrullinemia,CN)是奶牛的一種常染色體隱形遺傳性疾病。該病1989 年Dennis 等發(fā)現(xiàn),CN 是由于精氨酸琥珀酸合成酶(Arginino succinate synthetase,ASS)的基因第5 外顯子中,編碼ASS 第86 位氨基酸的密碼子由精氨酸突變?yōu)榻K止密碼子(CGA→TGA),造成了編碼的精氨酸琥珀酸合成酶失去活性,從而致使尿素循環(huán)發(fā)生代謝障礙。該病牛出生時(shí)表現(xiàn)正常,在出生1 周后就會(huì)由于血氨濃度過(guò)高而造成死亡,死亡率高達(dá)100%[1-3]。

由于該病隱性缺陷基因攜帶者不表現(xiàn)任何臨床癥狀,隱形缺陷基因可遺傳給子代個(gè)體,只有當(dāng)子代出現(xiàn)隱形純合子時(shí)才會(huì)被發(fā)現(xiàn)并淘汰,這將會(huì)給奶牛業(yè)的發(fā)展造成巨大的損失,同時(shí)也不利于奶牛育種的發(fā)展。

目前,國(guó)際上許多國(guó)家已經(jīng)開始進(jìn)行奶牛中CN攜帶者的篩查工作,主要的檢測(cè)方法為PCRRFLP、PCR-SSCP 和基因測(cè)序[4-6],這些方法不適合大規(guī)模的批量檢測(cè),本試驗(yàn)利用PCR-DHPLC 技術(shù),擬建立一種快速的高通量的檢測(cè)CN 的方法。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒 未突變純合子(A/A)基因材料:為構(gòu)建的含有部分SLC35A3 基因質(zhì)粒pMD-ASS;CN純合子(a/a)基因材料:為人工致突后質(zhì)粒pMDCN;CN 攜帶者(A/a)基因材料:pMD-ASS 與pMDCN 兩者的等比例混合物。所有質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑和儀器 三乙胺乙酸鹽(TEAA,色譜純),購(gòu)自Transgenomic 公司;乙腈(CAN,色譜純),購(gòu)自TEDIA 公司;質(zhì)粒DNA 小量提取試劑盒、PrimeSTAR HS DNA 聚合酶、DNA Marker DL-2 000,購(gòu)自TaKaRa 公司;其他常規(guī)化學(xué)試劑,購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司;變性高效液相色譜儀器(Transgenomic Wave 4 500),為北京環(huán)球基因公司產(chǎn)品。

1.3 PCR 擴(kuò)增 用Primer Premier 5.0 軟件,根據(jù)GenBank 中M26198 序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物,該引物對(duì)擴(kuò)增范圍包含第5 外顯子第86 位氨基酸:CN P1:5′-TATGACGTCATTGCCTACCTG-3′CN P2:5′-CGCATACTCCATCAGATCGTT-3′由寶生物工程(大連)有限公司合成,擴(kuò)增序列長(zhǎng)度為408 bp。分別以A/A、a/a 和A/a 基因材料為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系為:5×PrimeSTAR Buffer 10 μL,dNTPs 5 μL,引物各2 μL,各種基因型的模板各0.1 μL,PrimeSTAR HS DNA 聚合酶1 μL,補(bǔ)水至50 μL。反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃,5 min;94 ℃,30 s,55 ℃,30 s,72 ℃,30 min,35 個(gè)循環(huán);72 ℃,10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 變性高效液相色譜檢測(cè)方法的建立

1.4.1 變性條件 將a/a 和A/a 基因型的PCR 產(chǎn)物與A/A 基因型PCR 產(chǎn)物按l∶l 比例混合(各取7.5 μL 混勻),將混合后的PCR 產(chǎn)物按以下變性條件在PCR 儀上進(jìn)行變性:95 ℃變性5min,94.9 ℃變性6 s,然后通過(guò)700 個(gè)循環(huán)緩慢降溫,每個(gè)循環(huán)減少0.1 ℃,至25 ℃。變性后樣本準(zhǔn)備在DHPLC 上上樣,檢測(cè)。

1.4.2 DEIPLC 分析條件 利用WAVE 4500 的分析軟件預(yù)測(cè)ASS 擴(kuò)增基因的部分變性溫度,溫度條件通分析軟件對(duì)輸入的序列進(jìn)行解鏈溫度預(yù)測(cè)得出不同溫度的解鏈預(yù)測(cè)圖,在預(yù)測(cè)的溫度范圍內(nèi)選擇最佳溫度,以達(dá)到最理想的檢測(cè)效果。

運(yùn)行軟件Navigator software 自動(dòng)計(jì)算出最佳A液(0.1 mol/L TEAA 水溶液)和B 液(0.1 mol/L TEAA 和25%ACN)配比和洗脫梯度后,以0.9 mL/min 的流速將樣本在DNA 分離柱中洗脫。

1.5 方法的應(yīng)用 對(duì)山東地區(qū)進(jìn)境的荷斯坦奶牛55 份全血樣品提取基因組,按照建立的方法先進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將所有PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物與A/A 基因型的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行等體積混合,變性處理后,按照摸索的DHPLC 的分析條件上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 PCR 擴(kuò)增結(jié)果 經(jīng)過(guò)摸索,PCR 擴(kuò)增條件及體系如1.2 中所描述,產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),特異性良好。見圖1。

2.2 DHPLC 分析條件 根據(jù)序列的信息Navigator software 軟件對(duì)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物不同位點(diǎn)在59.2 ℃~63.2 ℃范圍內(nèi)的解鏈趨勢(shì)進(jìn)行了預(yù)測(cè),根據(jù)預(yù)測(cè)推薦使用溫度為63.2 ℃(見中插彩版圖2)。軟件計(jì)算得到最佳分析條件如下:0.0 min,47.8%緩沖溶液A,52.2%緩沖溶液B;0.5 min,42.8%緩沖溶液A,57.2%緩沖溶液B;5 min,33.8%緩沖溶液A,66.2%緩沖溶液B;5.1 min,0%緩沖溶液A,0%緩沖溶液B,100%緩沖溶液D;5.6 min,0%緩沖溶液A,0%緩沖溶液B,100%緩沖溶液D;5.7 min,47.8%緩沖溶液A,52.2%緩沖溶液B;6.6 min,47.8%緩沖溶液A,52.2%緩沖溶液B;流速:0.9 mL/min。

圖1 ASS 部分基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果

根據(jù)以上分析條件,對(duì)3 種基因型進(jìn)行Mutation detection 檢測(cè),得到如下圖譜結(jié)果(見中插彩版圖3)。

2.3 方法的應(yīng)用 55 份樣品均得到單一的大小正確的電泳條帶,利用建立的DHPLC 方法進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)了1 份A/a 基因型的樣品,將樣品PCR 產(chǎn)物送去測(cè)序結(jié)果與檢測(cè)結(jié)果一致(見中插彩版圖4)。

圖2 不同預(yù)測(cè)溫度DNA 雙螺旋的百分比

圖3 不同基因型樣本色譜圖

圖4 DHPLC 檢測(cè)結(jié)果與對(duì)應(yīng)的測(cè)序結(jié)果

3 討論

DHPLC 技術(shù)1995 年由Oefner 等建立的一種進(jìn)行核酸片段的分離和分析的方法,其SNP 檢測(cè)原理簡(jiǎn)單如下:雜合子個(gè)體的DNA 經(jīng)擴(kuò)增產(chǎn)生雜合二倍體,純合子個(gè)體的DNA 擴(kuò)增產(chǎn)生完全匹配的純合二倍體,兩種擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行變性后緩慢降溫復(fù)性,雜合子擴(kuò)增產(chǎn)物將形成同源雙鏈和異源雙鏈的混合物,而純化子擴(kuò)增產(chǎn)物則只有同源雙鏈一種,同源雙鏈和異源雙鏈的解鏈特征不同,在部分變性溫度(51 ℃~75 ℃)條件下,隨著流動(dòng)相中乙腈濃度呈線性增加的情況下與同源雙鏈相比,帶有突變序列的異源雙鏈在分離柱內(nèi)的保留時(shí)間相對(duì)較短。因此在色譜圖中,帶有突變序列的樣品呈現(xiàn)出異源和同源雙鏈兩個(gè)色譜峰,而不含突變序列的樣品則只有同源雙鏈一個(gè)峰[7-8]。

DHPLC 在檢測(cè)SNP 時(shí)不能區(qū)分A/A 和a/a 基因型的純合子,因此本研究將PCR 產(chǎn)物與A/A 基因型的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行等量混合,然后進(jìn)行變性復(fù)性處理,易于促使A/A 和a/a 基因型的形成異源雙鏈,有利于突變的檢出。理論上a/a 與A/A 基因型等量混合后形成的異源雙鏈與同源雙鏈的量是一樣的,形成的譜圖應(yīng)該是高度一致的雙峰,但是通常同源雙鏈的退火要優(yōu)于異源雙鏈,因此在結(jié)果中顯示同源峰要高于異源峰。從結(jié)果譜圖中A/A 和a/a 基因型均會(huì)出現(xiàn)雙峰的譜圖,但是由于a/a 基因型個(gè)體存活率為零,因此,在日常檢測(cè)中當(dāng)出現(xiàn)雙峰譜圖時(shí),即可認(rèn)為是A/A 基因型。

本試驗(yàn)使用質(zhì)粒作為不同基因型的基因材料,在方法建立過(guò)程中作為不同基因型的陽(yáng)性參考樣品,有利于方法建立過(guò)程中溫度、濃度及梯度的確立,使用55 份奶牛樣品對(duì)所建立的方法進(jìn)行了驗(yàn)證,通過(guò)與測(cè)序結(jié)果的比對(duì),證明所建立的PCRDHPLC 方法能夠應(yīng)用與臨床檢測(cè)。

DHPLC 在篩查單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)或基因突變方面具有準(zhǔn)確、敏感、高效、自動(dòng)化等特點(diǎn),是開展臨床基因診斷的一種有效手段。目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用到臨床診斷、腫瘤相關(guān)基因的篩選、遺傳性疾病篩查等領(lǐng)域[9-12]。本試驗(yàn)將該技術(shù)應(yīng)用于奶牛CN 檢測(cè)中,建立檢測(cè)方法,為將來(lái)大規(guī)模CN 篩查奠定基礎(chǔ)。