豬源殺鮭氣單胞菌分離鑒定及毒力因子檢測

鄧同煒,蔣增海,,霍元楠,宋 浩,何啟蓋

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,河南 鄭州450046;2.河南省豬病防控工程技術(shù)研究中心,河南 鄭州450046;3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢430070)

殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida),是一種最早被認(rèn)識(shí)的魚類病原菌,廣泛分布于淡水與海水中,除了作為人們最為熟知的鮭魚病原菌外,還可感染其他許多魚類品種,該菌分為5 個(gè)亞種,分別為殺鮭亞種(A.salmonicida subsp.salmonicida)、無色亞種(A.salmonicida subsp.achromogenes)、殺日本鮭亞種(A.salmonicida subsp.masoucida)、殺田唇烏蠅翼亞種(A.salmonicida subsp.smithia)和彭氏亞種(A.salmonicida subsp.Pectinolytica)[1]。Varshney A首次報(bào)道了1 例白內(nèi)障病人手術(shù)后2 周感染眼內(nèi)膜炎,是由殺鮭氣單胞菌導(dǎo)致[2]。Fontes 報(bào)道從屠宰場采集豬胴體、膈肌、脫毛器、糞便和水等樣品中,分離氣單胞菌,最后分離到嗜水氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌等9 個(gè)品種的氣單胞菌[3]。

2016 年10 月,河南漯河某養(yǎng)豬場存欄保育仔豬50 多頭,于2 周前,豬群的蹄部、口腔出現(xiàn)水皰,疑似口蹄疫感染,自愈后,又開始發(fā)病,臨床癥狀表現(xiàn)為咳嗽、喘氣、體溫升高等,死亡3 頭,送檢1 頭典型癥狀死亡的病例,剖檢病變?yōu)榉闻K充血、出血性病灶,脾臟淤血、邊緣有梗死。養(yǎng)殖戶反映,病初時(shí)懷疑為呼吸道病感染,使用強(qiáng)力霉素、阿莫西林或磺胺類藥物等拌料治療,無效,然后送檢本室診斷。通過臨床癥狀和病理剖檢,懷疑為細(xì)菌感染,通過無菌采集病料,首次從發(fā)病豬體內(nèi)分離到一株殺鮭氣單胞菌。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 綿羊鮮血瓊脂平板,購自鄭州博賽生物有限公司;營養(yǎng)肉湯、普通營養(yǎng)瓊脂,購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;2×Taq PCR Master Mix,購自南京諾唯贊生物科技有限公司;DL-2 000 DNA Marker、瓊脂糖和核酸染料,購自寶生物工程(大連)有限公司;生化試管,購自青島海博生物技術(shù)有限公司;MH 瓊脂、藥敏紙片,購自英國Oxoid 公司;大腸桿菌(ATCC25922)為質(zhì)控菌,由揚(yáng)州大學(xué)人獸共患病學(xué)江蘇省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。體重為20 g~25 g 健康昆明系小鼠由本校動(dòng)物房提供。

1.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)與染色鏡檢 無菌采集發(fā)病豬的肺、肝臟和脾臟,75%酒精棉球擦拭病料,并引火自燃,除去表面雜菌,同時(shí)火焰燃燒消毒剪刀、鑷子,剪去外表面的組織,取深部組織,接種血瓊脂平板,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,挑取形狀、大小和顏色一致的優(yōu)勢菌落,進(jìn)一步接種血瓊脂平板,純化2~3 代。同時(shí),挑取純化后的單菌落涂于載玻片,以無菌生理鹽水混勻,自然干燥,火焰上加熱固定,通過革蘭染色后顯微鏡下觀察。

1.3 分離菌的16S rDNA 分子鑒定 水煮沸法提取分離菌株的DNA 模板,參照文獻(xiàn)[4],合成通用引物 (16S-27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,16S-1492R:5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′),利用PCR 技術(shù)擴(kuò)增16S rDNA 片段,預(yù)期擴(kuò)增大小約1 500 bp,擴(kuò)增結(jié)果送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。將測序16S rDNA 結(jié)果 在NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTn 比對(duì),鑒定菌種。

1.4 分離菌的生化試驗(yàn) 使用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管,按生產(chǎn)廠家說明書要求的條件培養(yǎng),并在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)觀察結(jié)果,參照文獻(xiàn)[5]進(jìn)行結(jié)果判定。

1.5 分離菌的小鼠致病性試驗(yàn) 將分離純化菌株,接種于營養(yǎng)肉湯中,37 ℃恒溫條件下,過夜培養(yǎng),然后將其稀釋為5×108CFU/mL 菌液,采取灌胃接種,每只小鼠接種0.2 mL,共接種4 只。同樣,選擇4只小鼠作為對(duì)照組,每只小鼠接種無菌營養(yǎng)肉湯0.2 mL。觀察2 周,記錄小鼠的臨床表現(xiàn)。

1.6 分離菌的藥敏試驗(yàn) 以大腸桿菌(ATCC-25922)為質(zhì)控菌株,按照世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的K-B 和參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)手冊(cè)方法[6],對(duì)分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn),其結(jié)果按照上述手冊(cè)進(jìn)行判讀。

1.7 分離菌的毒力基因檢測 水煮沸提取細(xì)菌DNA 模板,參照文獻(xiàn)[7],合成6 對(duì)引物(見表1),利用PCR 技術(shù)擴(kuò)增分離菌株的毒力基因。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 擴(kuò)增不同毒力基因引物序列

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)與染色鏡檢結(jié)果 無菌采集肺臟、肝臟和脾臟,分別接種于血瓊脂平板,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后,均能生長成一種乳白色、濕潤、半透明、β 溶血、大小為2 mm~3 mm 的中心凸起呈圓錐形的優(yōu)勢菌落。革蘭染色為一種革蘭陰性桿菌,無芽孢和莢膜(見中插彩版圖1)。

圖1 分離菌株為革蘭陰性桿菌

2.2 分離菌的16S rDNA 分子鑒定 該分離菌株的16S rDNA 片段PCR 擴(kuò)增后,電泳檢測顯示獲得約1 500 bp 目的條帶(圖略)。擴(kuò)增產(chǎn)物測序比對(duì)分析后,其結(jié)果顯示分離菌株與NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫中殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種YZ-1 株的同源性最高,為99%。因此,將分離菌株鑒定為殺鮭氣單菌殺鮭亞種。

2.3 分離菌的生理生化特征 生化試驗(yàn)結(jié)果顯示,氧化酶試驗(yàn)為陽性,吲哚試驗(yàn)、V-P 試驗(yàn)陰性,甲基紅陽性,H2S 和脲酶試驗(yàn)為陰性,苯丙氨酸脫氨酶、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶為陰性,精氨酸雙水解酶為陽性,D-葡萄糖、D-阿拉伯糖、麥芽糖、D-甘露醇、海藻糖、ONPG 為陽性,丙二酸利用鹽、乳糖、纖維二糖、棉籽糖、L-鼠李糖、D-木糖、D-山梨醇為陰性。分離菌株符合殺鮭氣單胞菌特征。

2.4 分離菌的小鼠致病性試驗(yàn) 4 只小鼠攻毒接種以后,第3 天,均開始發(fā)病,表現(xiàn)為精神不振,倦怠,不愿走動(dòng),怕冷,第4 天死亡1 只,剩下3 只小鼠,2 周后康復(fù);4 只對(duì)照小鼠均正常。本試驗(yàn)表明分離菌株對(duì)小鼠具有一定致病性。

2.5 分離菌的藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明,該分離菌對(duì)磺胺異噁唑、四環(huán)素、土霉素、阿莫西林/克拉維酸、卡那霉素、氨芐西林、頭孢唑啉、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶耐藥;對(duì)慶大霉素、阿米卡星、頭孢噻呋、恩諾沙星、環(huán)丙沙星等敏感;對(duì)氯霉素中介(表2)。從藥敏試驗(yàn)結(jié)果來看,該分離菌株耐藥性嚴(yán)重,多種藥物均不能作為治療用藥,應(yīng)該根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果,選擇敏感的藥物如頭孢噻呋、慶大霉素或者恩諾沙星進(jìn)行治療。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.6 分離菌的毒力基因檢測 該分離菌株毒力基因PCR 檢測結(jié)果顯示,6 個(gè)被檢測毒力基因中act、ast、fla、lipase 檢測為陽性,alt、elastase 檢測為陰性(圖2),表明該分離菌株可能具有致病性。

圖2 毒力因子PCR 檢測結(jié)果

3 討論

針對(duì)人類,基于感染頻次,氣單胞菌臨床感染分為四大類:1.胃腸道綜合征;2.外傷和軟組織感染;3.菌血癥感染,例如免疫低下敗血癥感染;4.其他方面各種各樣的很少發(fā)生的感染[5]。因此,免疫力低下人群,容易患?xì)鈫伟哪c道外感染。本研究首次從疑似口蹄疫自愈后的病死仔豬體內(nèi),分離到1 株殺鮭氣單胞菌,表明豬群在感染口蹄疫后,造成免疫力下降,存在感染殺鮭氣單胞菌的風(fēng)險(xiǎn)。

本研究藥敏試驗(yàn)結(jié)果,表明該豬源殺鮭氣單胞菌分離菌株對(duì)獸醫(yī)臨床常用藥物如磺胺類藥物、四環(huán)素類藥物、β-內(nèi)酰胺類抗生素均耐藥,是導(dǎo)致養(yǎng)殖戶在送檢前進(jìn)行治療失敗的原因。據(jù)筆者調(diào)查,當(dāng)前養(yǎng)豬戶十分喜愛使用磺胺類藥物、強(qiáng)力霉素、阿莫西林或者氟苯尼考等粉劑拌料,用于預(yù)防或者治療豬病,可能是導(dǎo)致豬場病菌對(duì)這些藥物產(chǎn)生廣泛耐藥的基礎(chǔ),應(yīng)該引起注意;當(dāng)遇到治療細(xì)菌性豬病失敗時(shí),必須結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果,選擇敏感性藥物進(jìn)行治療,減少損失。

由于殺鮭氣單胞菌屬于魚類病原,以前沒有該菌感染豬群的報(bào)道,本次豬群殺鮭氣單胞菌屬首例,屬于跨種傳播感染。那么殺鮭氣單胞菌是從何處來的呢?是從環(huán)境中而來,還是從飼料中水產(chǎn)品攜帶而來呢?本次病例屬于偶然情況,還是具有普遍意義?有待于進(jìn)一步調(diào)查研究。