狂犬病病毒實(shí)時(shí)熒光RT-RPA 等溫檢測方法的建立

譚理琦,鄭曉聰,王翠萍,李汶松,秦智鋒

(1.深圳市福田區(qū)動(dòng)物防疫監(jiān)督所,廣東 深圳518045;2.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局,廣東 深圳518045;3.廣東藥科大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,廣東 廣州510000)

狂犬病病毒(RV)屬彈狀病毒科,狂犬病病毒屬,是有囊膜的單股負(fù)鏈RNA 病毒[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),目前全球已有87 個(gè)國家報(bào)道過狂犬病[2]。狂犬病病毒具有廣泛的宿主感染后能夠破壞神經(jīng)元細(xì)胞,同時(shí)在動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中大量繁殖,目前尚無有效的治療措施。被犬咬傷是狂犬病病毒的主要傳播途徑,此外,狂犬病還可通過消化道、抓傷、舔或觸摸傷口、母體胎盤、呼吸道等途徑傳播[3]。因此,對(duì)RV 建立快速、準(zhǔn)確的檢測方法是控制RV 感染的首要條件。

聚合酶重組酶擴(kuò)增技術(shù)(Recomninase Polymerase Amplification,RPA)是一種新型的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[4],其基本原理是在恒溫條件下,重組酶與寡核苷酸引物結(jié)合,形成酶和引物的復(fù)合體,酶促使引物定位在DNA 雙鏈模板的同源靶序列上,并在單鏈DNA 結(jié)合蛋白的協(xié)助下,解鏈模板DNA,隨后在DNA 聚合酶的作用下,形成新的DNA 互補(bǔ)鏈,從而實(shí)現(xiàn)了擴(kuò)增[4]。

RV 基因組主要編碼5 個(gè)主要的結(jié)構(gòu)蛋白:核蛋白(N),磷酸化蛋白(P),基質(zhì)蛋白(M),糖蛋白(G)和RNA 多聚酶(L)[5]。其中核蛋白(N)是狂犬病病毒相對(duì)穩(wěn)定并且拷貝數(shù)最多的蛋白,其作用是刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫[6-7]?？袢〔《綪V 株、ERA株以及CVS 株等核蛋白的氨基酸序列同源性高達(dá)98%以上,且含有兩個(gè)高度保守的區(qū)域[8-10]。因此本文主要針對(duì)狂犬病病毒N 基因保守區(qū)結(jié)合熒光RPA 技術(shù),設(shè)計(jì)特異性的引物,建立能夠快速、高效的檢測RV 的熒光RPA 等溫檢測方法,為我國RV的防控和診斷提供一種新型可靠的技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 病毒 犬瘟熱病毒、傳染性肝炎病毒、細(xì)小病毒、副流感病毒均為滅活病毒,Rabigen?mono 狂犬病滅活疫苗(VP12 株)、寵必威?銳必威犬、貓狂犬病病滅活疫苗、瑞貝康Rabisin?狂犬病滅活疫苗(G52 株)以及狂犬病病毒(CVS-11、JX-08-45)核酸由深圳市福田區(qū)動(dòng)物防疫監(jiān)督所提供,臨床樣品為深圳市福田區(qū)動(dòng)物防疫監(jiān)督所從寵物醫(yī)院采集。

1.2 主要儀器和試劑 超微量核酸蛋白濃度分析儀(BioDrop 公司)、T16-ISO 等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測儀(TwistDX 公司),純化試劑盒(Esay Pure Quick Gel Extraction Kit 公司)、核酸提取試劑盒(TaKaRa Mini BEST Viral RNA/DNA Extraction Kit 公司)、質(zhì)粒純化試劑盒(TaKaRa Mini BEST Plasmid Purification Kit 公司)、RT-PCR 試劑盒(TaKaRa PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit 公司)、RPA 核酸擴(kuò)增試劑。

1.3 引物和探針的設(shè)計(jì)與合成 參考NCBI 網(wǎng)上的數(shù)據(jù),利用DNAStar 進(jìn)行序列的同源性對(duì)比分析,選取N 基因高保守序列擴(kuò)增。利用Oligo 軟件設(shè)計(jì)6 對(duì)引物和探針,序列如表1。

表1 RPA 的引物和探針

1.4 病毒RNA 的提取及濃度測定 采用核酸試劑盒(TaKaRa Mini BEST Viral RNA/DNA Extraction Kit 公司)提取犬瘟熱病毒、傳染性肝炎病毒、細(xì)小病毒、副流感病毒、狂犬病病毒(CVS-11、JX-08-45)與Rabigen?mono 狂犬病滅活疫苗(VP12 株)、寵必威?銳必威犬、貓狂犬病滅活疫苗、瑞貝康Rabisin?狂犬病滅活疫苗(G52 株)的RNA,用超微量核酸蛋白濃度分析儀測定核酸濃度。

1.5 熒光RT-RPA 反應(yīng)體系及反應(yīng)條件 熒光RT-RPA 擴(kuò)增使用試劑盒TwistAmp exo RT(TwistDx公司)進(jìn)行試驗(yàn),先把再水化緩沖液29.5 μL 加入到凍干酶球的反應(yīng)管中,然后加入10 μmol/L 的引物各2.1 μL,10 μmol/L 的探針0.6 μL,DEPC 水11.2 μL,模板2 μL,最后加入280 mmol/L 的醋酸鎂溶液2.5 μL,混勻,置于T16-ISO 等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測儀中,39 ℃運(yùn)行20 min,實(shí)時(shí)觀察檢測結(jié)果。

1.6 引物及探針的篩選 將設(shè)計(jì)的4 條引物和1條探針(見表1)進(jìn)行配對(duì)組合,以狂犬病病毒核酸為模板,根據(jù)1.5 中反應(yīng)體系進(jìn)行配置,篩選出較優(yōu)的組合作為本次試驗(yàn)的引物與探針。

1.7 靈敏性試驗(yàn)

1.7.1 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù)RV N 基因序列設(shè)計(jì)引 物,序 列 如 下,RV-N-F:5′-ACGCTTAACAACAAAACCATAGAAG-3′; RV-N-R: 5′-CGGATTGACGAAGATCTTGCTCAT-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

以狂犬病病毒核酸為模板,使用引物RV-N-F、RV-N-R 進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增,體系為:2× One Step RT-PCR Buffer 12.5μL,PrimeScript One Step Enzyme Mix 1.0 μL,20 μmol/L 的上下游引物各0.5 μL,無菌水8.5 μL,模板2 μL。按以下條件進(jìn)行反應(yīng):逆轉(zhuǎn)錄50 ℃30 min;預(yù)變性94 ℃2 min;94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min,共30 個(gè)循環(huán);然后72 ℃10 min,4 ℃保存。

將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并膠回收,連接到pMD18-T Vector,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中構(gòu)建重組菌pMD18-T-N/DH5α。選擇陽性克隆鑒定正確后過夜培養(yǎng)提取質(zhì)粒,使用超微量核酸蛋白濃度分析儀對(duì)質(zhì)粒濃度進(jìn)行測定并計(jì)算質(zhì)粒的拷貝數(shù)。

1.7.2 靈敏度測試 將篩選的引物與探針進(jìn)行靈敏度測試。將上述構(gòu)建好的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作10 倍梯度,并用ddH2O 作陰性對(duì)照,進(jìn)行熒光RPA 擴(kuò)增。

1.8 特異性試驗(yàn) 以狂犬病病毒、犬瘟熱病毒、傳染性肝炎病毒、細(xì)小病毒、副流感病毒等犬類相關(guān)病毒進(jìn)行測試。

1.9 臨床應(yīng)用 從寵物醫(yī)院采集的樣品以及購置的狂犬病病毒疫苗,共19 份樣品,提取核酸后,作為臨床樣品進(jìn)行檢測。同時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)《SN/T 4087-2014狂犬病檢疫技術(shù)規(guī)范》所述的熒光PCR 方法進(jìn)行比對(duì),測試方法的臨床效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物探針的確認(rèn) 用狂犬病病毒核酸為模板,以引物RV F1/R1、F1/R2、F2/R1、F2/R2 等組合并結(jié)合探針RV P 進(jìn)行測試,并做陰性對(duì)照,結(jié)果見封三彩版圖1,各組合均能對(duì)狂犬病病毒核酸進(jìn)行擴(kuò)增,其中引物F1/R1 組合擴(kuò)增曲線起飛時(shí)間較早,選為本研究的較優(yōu)引物,進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)。

2.2 靈敏性試驗(yàn) 將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10 倍系列稀釋,其核酸濃度為1.83 Copies/μL ~ 1.83×109Copies/μL,并做陰性對(duì)照,用熒光RT-RPA 進(jìn)行靈敏度試驗(yàn),結(jié)果見封三彩版圖2。

結(jié)果顯示,模板濃度為1.83×101Copies/μL ~1.83×109Copies/μL 1 h,可看到明顯的擴(kuò)增曲線,濃度為1.83 Copys/μL 無擴(kuò)增曲線。因此,在本次試驗(yàn)中RPA 方法的最低可檢測的核酸濃度為1.83×101Copys/μL。由此可見,熒光RT-RPA 方法有很高的靈敏度,并且檢測時(shí)間只需20 min,一般情況下運(yùn)行5 min就可觀察到擴(kuò)增曲線,并可實(shí)時(shí)觀察擴(kuò)增曲線。

2.3 特異性試驗(yàn) 以狂犬病病毒、犬瘟熱病毒、傳染性肝炎病毒、細(xì)小病毒、副流感病毒為RNA 模板,采應(yīng)用熒光RT-RPA 進(jìn)行特異性檢測,并用ddH2O作陰性對(duì)照。結(jié)果見封三彩版圖3 顯示,以狂犬病病毒為模板有明顯的擴(kuò)增曲線;而犬瘟熱病毒、傳染性肝炎病毒、細(xì)小病毒、副流感病毒等樣品無擴(kuò)增曲線。因此,本試驗(yàn)建立的檢測狂犬病病毒的熒光RT-RPA 方法具有較好的特異性。

2.4 臨床樣品檢測 從寵物醫(yī)院采集的臨床樣品以及購置的狂犬病病毒疫苗,共24 份樣品,提取核酸后,進(jìn)行熒光RT-RPA 檢測。同時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)《SN/T 4087-2014 狂犬病檢疫技術(shù)規(guī)范》所述的熒光PCR方法進(jìn)行比對(duì),結(jié)果顯示,3 株狂犬病滅活疫苗均為陽性,其他動(dòng)物樣品結(jié)果呈陰性,熒光RT-RPA 檢測結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法檢測結(jié)果一致。

圖1 RPA 檢測RV

圖2 靈敏性試驗(yàn)

圖3 特異性試驗(yàn)

3 討論

狂犬病全球范圍內(nèi)流行,感染后死亡率極高。建立一種準(zhǔn)確、快速的RV 檢測方法對(duì)我國防控該疫病具有重大意義。目前已有多種RV 檢測方法及應(yīng)用,如2007 年王曉虎[11]利用熒光抗體病毒中和試驗(yàn)將定量血清與狂犬病病毒CVS 在體外中和,2008 年張靜文[12]應(yīng)用RT-PCR 技術(shù)擴(kuò)增RV N 基因,2011 年黃元[13]建立了檢測狂犬病病毒核酸RT-LAMP 技術(shù)。然而各種技術(shù)都存在一定的優(yōu)勢(shì)與不足,如:熒光與抗體病毒中和試驗(yàn),此方法在細(xì)胞培養(yǎng)上的效果最好,但野外采集的血清質(zhì)量低劣,在試驗(yàn)進(jìn)行時(shí)細(xì)胞會(huì)對(duì)毒素太過敏感從而產(chǎn)生假陽性。RT-PCR 在大規(guī)模樣品的初步篩選中結(jié)果直觀,容易判定,但是結(jié)果也會(huì)受非特異性序列變異、病毒稀釋間接性、樣品采集時(shí)間、樣品類型等影響。而RT-LAMP 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù),現(xiàn)如今已運(yùn)用于多個(gè)領(lǐng)域,該技術(shù)于PCR 技術(shù)相比,具有更高的靈敏度和特異性,反應(yīng)快速,70 min就可以顯示結(jié)果,同時(shí)不需要電泳,可添加著色劑直接用肉眼判斷結(jié)果。然而,該技術(shù)的原理復(fù)雜,需要設(shè)置多對(duì)引物,對(duì)引物的要求極高,同時(shí)該檢測方法的靈敏度極高,容易出現(xiàn)假陽性[14-15]。

本試驗(yàn)結(jié)合重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù),建立了RV-RPA 檢測方法。通過了靈敏度、特異性以及臨床檢驗(yàn)驗(yàn)證,確定了檢測方法的可靠性。狂犬病病毒除接種狂犬疫苗外,無其他有效的治療方法,因此接種疫苗以及早期的診斷極為重要。然而高靈敏度是作為診斷技術(shù)中的重要參數(shù)之一,高靈敏度可以更有效的判斷家畜以及人類體內(nèi)是否含有狂犬病病毒,為盡快采取有效措施提供依據(jù)。特異性強(qiáng)。試驗(yàn)結(jié)果顯示,該檢測體系除狂犬病病毒檢測為陽性,其余犬類病病毒檢測結(jié)果皆為陰性,表明建立的方法特異性強(qiáng),更加肯定RPA 技術(shù)的實(shí)用性。RPA技術(shù)不僅儀器簡便,檢測條件也很簡單。反應(yīng)溫度為39 ℃,無需變溫,消耗時(shí)間短,20 min 即可得到檢測結(jié)果。加入熒光探針,可以實(shí)時(shí)觀察到檢測結(jié)果。

目前,RPA 技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于快速檢測動(dòng)物疫病,如Aebischer、Abd、Wang 等[16-18]應(yīng)用等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)對(duì)動(dòng)物疫病進(jìn)行檢測。因此,RV 熒光RPA檢測體系相對(duì)于其他檢測狂犬病病毒的檢測方法,具有明顯的優(yōu)越性,也為實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測提供一種可能。然而,RPA 作為一種新興的技術(shù),還存在很多不足。其中引物和探針的設(shè)計(jì)是該方法成功與否的關(guān)鍵。RPA 技術(shù)中引物和探針的設(shè)計(jì)沒有PCR技術(shù)發(fā)展得這么成熟,沒有特定用于該引物和探針設(shè)計(jì)的軟件,只能借鑒PCR 引物設(shè)計(jì)的軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)。不過RPA 結(jié)果真實(shí)可靠,且該方法反應(yīng)操作簡便、對(duì)儀器要求較低,非常適用于基層診斷實(shí)驗(yàn)室和養(yǎng)殖場檢測。隨著RPA 技術(shù)的不斷改進(jìn),該技術(shù)一定可以得到快速的發(fā)展與應(yīng)用。