沙門菌馬流產(chǎn)凝集試驗(yàn)陽性血清國家參考品的制備及標(biāo)定

王秀麗,魏財文,張 媛,彭國瑞,李 建,辛凌翔,張一幟,蔣玉文

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 海淀100081)

馬沙門菌病的病原主要為馬流產(chǎn)沙門菌,由于感染動物的年齡、性別不同,其臨床癥狀也不一致,孕馬主要表現(xiàn)為流產(chǎn);幼駒感染后發(fā)生敗血癥、關(guān)節(jié)炎和腹瀉,有時出現(xiàn)支氣管肺炎;公馬表現(xiàn)為睪丸炎、鬢甲腫等。該病發(fā)生于世界各地,國內(nèi)主要發(fā)生在種馬場[1]。該病的診斷主要靠沙門菌馬流產(chǎn)凝集試驗(yàn),根據(jù)我國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)。沙門菌馬流產(chǎn)凝集試驗(yàn)陽性血清國家參考品的制備和標(biāo)定對于沙門菌馬流產(chǎn)凝集試驗(yàn)抗原及陽性血清、陰性血清的生產(chǎn)及成品和半成品的檢驗(yàn)具有重要意義。

本研究按照2015 版《中國獸藥典》和《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》二〇〇〇版的有關(guān)規(guī)定及國家對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究的相關(guān)要求,結(jié)合以往沙門菌馬流產(chǎn)凝集試驗(yàn)陽性血清參考品制備、標(biāo)定的經(jīng)驗(yàn),進(jìn)一步規(guī)范了沙門菌馬流產(chǎn)凝集試驗(yàn)陽性血清國家參考品的制備、標(biāo)定方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 菌種及試劑 馬流產(chǎn)沙門菌C77-1 株,由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管和供應(yīng),沙門菌馬流產(chǎn)凝集試驗(yàn)抗原國家參考品,效價為1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400 的沙門菌馬流產(chǎn)凝集試驗(yàn)陽性血清參考品由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備和標(biāo)定,普通瓊脂、普通肉湯、TG、TSB 培養(yǎng)基,購自北京中海生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 抗原的制備 開啟凍干菌種,用1 mL 普通肉湯溶解后,用接種環(huán)取少量菌液劃線接種普通瓊脂平板,37 ℃培養(yǎng)24 h,選取光滑的典型菌落接種于普通瓊脂斜面,37 ℃培養(yǎng)20~24 h,對菌種進(jìn)行檢定[2,3],挑取檢定合格的種子接種普通瓊脂斜面中管若干支,經(jīng)肉眼檢查純粹后,每只中管加入6~8 mL 生理鹽水將菌體洗下,收集到含有滅菌玻璃珠的250 mL 的分裝瓶中,按照菌液總量的1%加入甲醛溶液,搖碎菌塊,用滅菌紗布漏斗過濾后置于37 ℃滅活24 h,無菌檢驗(yàn)合格后用細(xì)菌比濁標(biāo)準(zhǔn)管調(diào)整菌液濃度至1.0×1010CFU/mL[3]。

1.2.2 免疫程序 用制備好的抗原以0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL 分3 次靜脈注射體重為1.5~2.0 kg的健康家兔15 只,每次免疫時間間隔為5~6 d,最后1 次免疫后5~7 d 后每只兔子耳動脈采血2 mL,分離血清,測定每只兔子的血清效價,兔子血清效價不低于1∶6 400 時可以采血。

1.2.3 血清效價測定 常量法:將待檢血清、效價為1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400 陽性血清參考品及陰性血清各1 份,分別作1 ∶100、1 ∶200、1 ∶400……1∶6 400稀釋。取各稀釋度血清1.0 mL 于1 支試管,每管加入1∶20 稀釋的沙門菌馬流產(chǎn)凝集試驗(yàn)抗原國家參考品1.0 mL。另將1∶20 稀釋的沙門菌流產(chǎn)凝集試驗(yàn)抗原國家參考品1.0 mL 加入1.0 mL 生理鹽水中作為對照,以觀察抗原是否自凝。將各組試管振搖混勻,置37 ℃反應(yīng)20 h 后室溫靜置2 h[4]。

抗原國家參考品與效價標(biāo)識為1 ∶1 600、1∶3 200、1 ∶6 400 的陽性血清參考品,在其最終稀釋度分別為1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400 均出現(xiàn)不低于“++”凝集,而在其最終稀釋度分別為1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800 均出現(xiàn)“+”或“-”凝集;與最終稀釋度為1∶200 的陰性血清不發(fā)生凝集,并在生理鹽水對照管中不自凝時,試驗(yàn)結(jié)果有效。

微量法:在96 孔U 型反應(yīng)板的第1 列分別加入200 μL 1∶100 倍稀釋的待檢血清,3 種效價的陽性血清參考品和陰性對照血清,第2~9 列分別加入100 μL 5%苯酚生理鹽水,從第1 列中吸取100 μL 的血清依次2 倍系列稀釋至第8 列,吸棄100 μL,第9 列作為抗原對照,分別加入1∶20 稀釋的沙門菌馬流產(chǎn)凝集試驗(yàn)抗原國家參考品100 μL,充分混勻后置37 ℃反應(yīng)20 h 后室溫靜置2 h。判定結(jié)果。

1.2.4 沙門菌馬流產(chǎn)凝集試驗(yàn)陽性血清國家參考品候選物的制備 兔子血清效價不低于1∶6 400 以后,心臟采血,分離血清,將血清混勻后按照1.2.3的方法測定混合血清的效價,同時用200 μL 的體系測定微量凝集效價?；旌涎灏船F(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行無菌檢驗(yàn)。

將無菌檢驗(yàn)合格的效價為1∶6 400 的血清與健康兔血清1∶1混合,配制成效價為1∶3 200 的陽性血清參考品候選物,將效價為1∶6 400 的血清與健康兔血清1∶3混合配制成效價為1∶1 600 陽性血清參考品候選物,效價為1∶6 400 的混合血清直接作為1∶6 400 的陽性血清參考品候選物,分別配制2.0 mL,將配制的陽性血清候選物按1.2.3 的方法測定效價。

效價測定結(jié)果與預(yù)期血清效價結(jié)果一致后,按以上比例配制陽性血清國家參考品,按照血清總量的0.01%加入硫柳汞。1.0 mL/支分裝于安瓿瓶中,按照特定的凍干曲線凍干,抽真空封口。

1.2.5 成品檢驗(yàn) 按照《中國獸藥典》中對沙門菌馬流產(chǎn)凝集試驗(yàn)陽性血清的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相關(guān)規(guī)定,該陽性血清參考品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為:1 性狀 本品為疏松物質(zhì),加生理鹽水后迅速溶解;2 無菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn),應(yīng)無菌生長;3 效價測定 按照1.2.3 測定血清的效價,血清效價測定結(jié)果應(yīng)與標(biāo)識的血清效價結(jié)果一致;4 剩余水分測定 按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行測定,應(yīng)小于3.0%;5 真空度測定 按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行測定,應(yīng)符合規(guī)定;6 均一性 效價為1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400的血清成品各隨機(jī)抽取3 支,按1.2.3 項進(jìn)行效價測定,3 種血清效價應(yīng)與前一批次對應(yīng)效價的陽性血清參考品(1 ∶1 600、1 ∶3 200、1∶6 400)效價均一致,且每種效價的血清的3 個樣品的效價應(yīng)相同。

2 結(jié)果

2.1 免疫兔血清效價測定結(jié)果 經(jīng)3 次免疫后,對10 只免疫兔分別耳靜脈采血,分離血清,按照1.2.3 的方法測定每只兔血清的凝集效價,結(jié)果見表1。

表1 免疫兔血清效價測定結(jié)果

2.2 混合血清效價測定結(jié)果 按照常量測定法10只兔子血清效價均高于1∶6 400,將10 份兔血清混合后,按照1.2.3 的方法測定混合血清的效價,同時用微量凝集法測定效價,結(jié)果見表2。

表2 混合血清效價測定結(jié)果

2.3 沙門菌馬流產(chǎn)凝集試驗(yàn)陽性血清國家參考品候選物預(yù)配制及效價測定 對按1.2.4 預(yù)配置的3種效價的陽性血清國家參考品候選物進(jìn)行效價測定,結(jié)果見表3。

表3 沙門菌馬流產(chǎn)凝集試驗(yàn)陽性血清參考品候選物預(yù)試驗(yàn)樣品效價測定結(jié)果

效價為1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400 的沙門菌馬流產(chǎn)凝集試驗(yàn)陽性血清參考品試劑測定效價為1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400,陰性對照血清與抗原不發(fā)生凝集反應(yīng),抗原與0.5%的苯酚生理鹽水反應(yīng)無自凝現(xiàn)象,試驗(yàn)成立,此時,試配制的效價為1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400 的陽性血清國家參考品候選物測定效價為1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400,因此,可以按照試配比例配制相應(yīng)效價的血清參考品。配制完成后用帶16 號長針頭的注射器等量分裝血清,1.0 mL/支,按特定的凍干曲線凍干。

2.4 成品檢驗(yàn) 效價為1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400的血清均為疏松物質(zhì),加入生理鹽水后迅速溶解,按照現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行無菌檢驗(yàn)、剩余水分、真空度測定,無菌檢驗(yàn)結(jié)果5/5 無菌生長,剩余水分測定結(jié)果均小于3%,真空度測定結(jié)果顯示,凍干的血清均呈現(xiàn)白色、粉色或紫色輝光,均符合規(guī)定。效價測定結(jié)果顯示,新制備的沙門菌馬流產(chǎn)凝集試驗(yàn)陽性血清參考品與前一批次對應(yīng)效價的血清參考品效價一致,結(jié)果見表4;均一性試驗(yàn)結(jié)果顯示,每種效價隨機(jī)抽取的3 支血清效價一致,且與對應(yīng)效價的陽性血清參考品效價一致,結(jié)果見表5。

表4 沙門菌馬流產(chǎn)凝集試驗(yàn)陽性血清參考品常量法效價測定結(jié)果

表5 沙門菌馬流產(chǎn)凝集試驗(yàn)陽性血清參考品均一性試驗(yàn)常量法測定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

沙門菌馬流產(chǎn)凝集試驗(yàn)是目前診斷馬沙門菌病的主要實(shí)驗(yàn)室方法[5],病原分離鑒定也可以用于馬沙門菌病的診斷,但不是在所有感染階段均可以分離到細(xì)菌,LAMP 和PCR 等核酸檢測方法也有研究[6],但因其影響因素較多,假陽性和假陰性結(jié)果不時出現(xiàn),也未推廣應(yīng)用。沙門菌馬流產(chǎn)凝集試驗(yàn)診斷抗原、陽性對照血清、陰性對照血清的質(zhì)量直接關(guān)系到診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性,因此建立沙門菌馬流產(chǎn)凝集試驗(yàn)陽性血清國家參考品對于抗原國家參考品、血清國家參考品的標(biāo)定以及診斷抗原和對照血清的生產(chǎn)均具有十分重要的意義。

根據(jù)《中國獸藥典》2015 年版標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保存期的規(guī)定,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)原則上不設(shè)保存期,沙門菌馬流產(chǎn)凝集試驗(yàn)陽性血清的保存期為在2 ℃~8 ℃保存,有效期為96 個月。有研究結(jié)果顯示,馬流產(chǎn)沙門菌凍干陽性血清置于2 ℃~8 ℃保存13 年,其效價不降低,仍能達(dá)到《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),建議沙門菌馬流產(chǎn)陽性凍干血清的保存期延長至10 年{4,7}。因此,該參考品置于2 ℃~8 ℃保存,至少可以保存10 年。

沙門菌馬流產(chǎn)凝集試驗(yàn)?zāi)壳坝玫姆椒ㄊ窃谛A底試管中用2 mL 的體系進(jìn)行試驗(yàn),該方法的結(jié)果判定不清晰,新手操作很難確定凝集終點(diǎn),不同人員對同一實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定差異大。本研究同時用2.0 mL 的體系和200 μL 的微量凝集體系進(jìn)行平行試驗(yàn),結(jié)果顯示,微量凝集試驗(yàn)的結(jié)果均比傳統(tǒng)試管凝集試驗(yàn)的結(jié)果敏感一個滴度,且微量凝集試驗(yàn)在微量反應(yīng)板上進(jìn)行,操作方便,省時省力,結(jié)果清晰,將來無論是馬流產(chǎn)沙門菌實(shí)驗(yàn)室診斷還是沙門菌馬流產(chǎn)凝集試驗(yàn)抗原參考品、血清參考品以及診斷抗原和對照血清的制備中均可以考慮用微量凝集法替代傳統(tǒng)的常量法。