非洲豬瘟病毒K196 R 基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR 檢測方法的建立

崔貝貝,仇松寅,梅 琳,韓雪清,吳紹強(qiáng),李 霆,林祥梅

(中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院,北京 大興100176)

非洲豬瘟(African swine fever,ASF)由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起,是家豬和野豬的一種高度接觸性、致死性傳染病[1]。ASFV是非洲豬瘟病毒科中的唯一成員,只有一個血清型,有24 個基因型[2]。病毒粒子的直徑是175~215 nm,呈20 面體對稱,基因組為雙股線狀DNA,大小為170~190 kb,基因組含有160~175 個開放閱讀框(ORF),編碼150~200 種蛋白質(zhì)[3,4]。ASFV病毒粒子的基因組大,基因易變異,病毒編碼的蛋白種類繁多,病毒存活力強(qiáng),可通過多種途徑和方式進(jìn)行有效傳播,這是導(dǎo)致ASFV 在染疫國家和地區(qū)呈地方性流行的重要原因之一。2018 年8 月3日我國發(fā)生首起非洲豬瘟疫情[5],此后3 個多月內(nèi),已有18 個省份累計(jì)暴發(fā)69 起[6],給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了沉重打擊。從目前ASF 全球流行態(tài)勢及世界各國的防控經(jīng)驗(yàn)來看,我國面臨的形勢異常嚴(yán)峻,ASF 的消除和凈化工作已經(jīng)被提到日程,ASF 診斷技術(shù)研究與應(yīng)用對我國ASF 的防控和根除顯得尤為重要。

常用于檢測ASF 的實(shí)驗(yàn)室診斷方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、直接/間接免疫熒光、血細(xì)胞吸附反應(yīng)(Hemadsorption,HAD)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、普通PCR 和熒光定量PCR 等。由于ASF 通常導(dǎo)致豬只迅速死亡,目前ASF 的實(shí)驗(yàn)室診斷以檢測核酸為主。而PCR 法,尤其是實(shí)時(shí)熒光定量PCR 具有靈敏度高、污染率低、適用樣品類型多的優(yōu)點(diǎn),近年來在各個領(lǐng)域特別是在基因檢測方面被廣為應(yīng)用[7]。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)推薦的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR,檢測方法準(zhǔn)確度高,但僅以表達(dá)結(jié)構(gòu)蛋白P72 的B646L 基因?yàn)榘袠?biāo),相對單一,故開發(fā)新型的ASFV 早期基因診斷靶標(biāo)有助于盡早確定疫情。經(jīng)序列比對分析,ASFV K196R 基因序列高度保守。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道K196R 基因在病毒感染早期就可以在感染動物的血液中檢測到[8],且K196R 基因的編碼產(chǎn)物也是非洲豬瘟病毒的一種免疫顯著抗原[9],但以ASFV K196R 基因作為靶基因進(jìn)行熒光定量PCR 檢測ASFV,至今鮮有報(bào)道。基于此,本研究以K196R 基因作為非洲豬瘟病毒早期檢測靶基因,選取基因組保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針,建立了TaqMan 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測方法,以期為開發(fā)新型ASFV 檢測試劑盒提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 偽狂犬病活疫苗(Kartha-K61株),購自齊魯動物保健品有限公司;豬細(xì)小病毒病滅活疫苗(WH-1),購自中牧實(shí)業(yè)股份有限公司;豬圓環(huán)病毒2 型滅活疫苗(LG 株),購自獸藥集團(tuán)生物疫苗有限公司;整合K196R 基因的細(xì)胞系由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動檢所建立并保存。QuantiNova SYBR Green PCR Kit(Cat No.208052)、QuantiNova Probe PCR Kit(Cat No.208254)、DNeasy Blood&Tissue Kit(Cat No.69506)以及jetPRIME DNA&siRNA Transfection Reagent 等試劑,均購自北京宏捷科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物和探針的設(shè)計(jì) 參考GenBank 中公布的格魯吉亞豬ASFV K196R 基因核苷酸序列(FR682468.1),設(shè)計(jì)了1 對特異性引物和1 條探針,如表1 所示。引物和探針均由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

表1 K196R 基因的引物、探針序列

1.2.2 病毒基因組DNA 的提取 按照病毒基因組DNA 提取試劑盒(Cat No.69506)操作說明書,提取偽狂犬病活疫苗(Kartha-K61 株)、豬細(xì)小病毒病滅活疫苗(WH-1)和豬圓環(huán)病毒2 型滅活疫苗(LG株)的全基因組DNA。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析系統(tǒng)的建立

1.2.3.1 PCR 反應(yīng)體系條件優(yōu)化 按照QuantiNova Probe PCR 試劑盒說明書提供的反應(yīng)體系(表2),將退火溫度分別設(shè)置為56 ℃、58 ℃、59 ℃、59.5 ℃、60 ℃、60.5 ℃、61 ℃、62 ℃、64 ℃,9 個溫度梯度,優(yōu)化退火溫度。引物濃度從200、300、400、500、600 nmol/L,探針濃 度從50、100、200、300、400 nmol/L,分別稀釋5 個濃度梯度,以最佳的退火溫度分別優(yōu)化引物和探針濃度。選取最低的Ct值和最高的ΔR(熒光強(qiáng)度增加值),如果Ct 值和ΔR 不一致時(shí),則優(yōu)先考慮Ct 值。循環(huán)條件為:預(yù)變性95 ℃、2 min;以95 ℃、5 s,60 ℃、30 s,擴(kuò)增40 個循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后,驗(yàn)證反應(yīng)體系及其引物的特異性。1.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 陽性克隆質(zhì)粒pUC57-ASFV-K196R 由北京六合華大基因科技股份有限公司合成并測序,測序無誤后,采用全自動酶標(biāo)儀測定質(zhì)粒的濃度和純度。參照文獻(xiàn)[10]介紹的質(zhì)?？截悢?shù)公式,計(jì)算出每微升標(biāo)準(zhǔn)品中所含的拷貝數(shù)。對陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行10 倍的倍比稀釋,得到100~108copies/μL 等9 個稀釋度的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品模板,按照1.2.3.1 優(yōu)化的方法,進(jìn)行TaqMan 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)體系

1.2.3.3 靈敏性試驗(yàn) 以重組質(zhì)粒pUC57-ASFVK196R 為標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒,分別做10 倍的倍比稀釋,每個模板濃度作3 個平行樣。根據(jù)已經(jīng)建立的TaqMan 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行相應(yīng)的PCR 擴(kuò)增,通過觀察擴(kuò)增曲線來確定檢測到重組質(zhì)粒的最低拷貝數(shù),并最終以Ct 值為縱坐標(biāo),兩種基因拷貝數(shù)為橫坐標(biāo),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,對整個PCR 體系的靈敏性進(jìn)行評價(jià)。

1.2.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法的特異性檢測 采用TaqMan 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)體系,以pUC57-ASFV-K196R 的重組質(zhì)粒DNA 作為標(biāo)準(zhǔn)的陽性對照。 偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬細(xì)小病毒基因組DNA 作為其他毒株模板,無菌水作為陰性對照;使用ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增,以驗(yàn)證所建立診斷方法的特異性。

1.2.3.5 細(xì)胞系的篩選與鑒定 用針對K196R 基因設(shè)計(jì)的特異性引物,以重組質(zhì)粒pUC57-ASFVK196R DNA 為模板,擴(kuò)增出K196R 特異性片段,與pcDNA4-Flag 載體連接,經(jīng)酶切鑒定與測序正確后,按照jetPRIME?DNA&siRNA 轉(zhuǎn)染試劑說明書,將構(gòu)建的pcDNA4-Flag-K196R 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入提前準(zhǔn)備好的PK-15 細(xì)胞中。24 h 后,分別按照1×105個/mL,2×105個/mL,4×105個/mL,6×105個/mL 的細(xì)胞濃度,將細(xì)胞重新鋪在20 mm ×100 mm 的細(xì)胞培養(yǎng)皿中,每個平皿中加入終濃度為30 ng/mL 的Zeocine。待培養(yǎng)皿中長出單克隆后,取單克隆細(xì)胞株做Western Blotting 鑒定,將flag 標(biāo)簽抗體陽性且穩(wěn)定表達(dá)分子量在23 kDa 的K196R 細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列比對 從GenBank 數(shù)據(jù)庫中下載28 條ASFV 代表性毒株的全基因組序列,利用DNAStar軟件對序列進(jìn)行比對與分析,發(fā)現(xiàn)K196R 基因序列高度保守,序列比對結(jié)果如圖1 所示。

2.2 ASFV 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析系統(tǒng)的優(yōu)化與建立

2.2.1 ASFV K196R 基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR 熔解曲線 pUC57-ASFV-K196R 陽性重組質(zhì)粒按照QuantiNova SYBR Green PCR Kit(Cat No.208052)說明書進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果顯示,K196R 基因的熔解曲線在Tm 值為77.79 處有單一峰,可知引物無非特異性擴(kuò)增。

2.2.2 ASFV K196R 基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR 退火溫度的優(yōu)化 通過分析K196R 基因引物對的Tm值,分別選取56 ℃、58 ℃、59 ℃、59.5 ℃、60 ℃、60.5 ℃、61 ℃、62 ℃、64 ℃,9 個不同的退火溫度進(jìn)行TaqMan 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增,通過對不同退火溫度擴(kuò)增曲線的Ct 值進(jìn)行比較,結(jié)果顯示,60 ℃時(shí)的Ct 值為17.448,是9 個不同退火溫度擴(kuò)增結(jié)果中的最小值,因此退火溫度為60 ℃時(shí)pUC57-ASFVK196R 陽性重組質(zhì)粒的擴(kuò)增效率最高。 如表3所示。

表3 ASFV K196R 基因不同Tm 值擴(kuò)增曲線的Ct 值

2.2.3 ASFV K196R 基因的引物濃度優(yōu)化 通過對200、300、400、500、600 nM 等5 個不同濃度的上下游引物按照QuantiNova Probe PCR 試劑盒說明書提供的反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增結(jié)束后分別統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增曲線的Ct 值和ΔR 值,得到在上下游引物濃度為0.4 μM 時(shí)pUC57-ASFV-K196R 陽性重組質(zhì)粒的擴(kuò)增效率最高。所以上下游引物的最佳濃度為0.4 μM。如圖2 所示。

2.2.4 ASFV K196R 基因的探針濃度優(yōu)化 探針濃度按照50、100、200、300、400 nM,稀釋5 個濃度梯度。根據(jù)QuantiNova Probe PCR 試劑盒說明書提供的反應(yīng)體系,以優(yōu)化好的引物濃度和Tm 值,在ABI 7500 儀器上擴(kuò)增,得到如圖3 所示的擴(kuò)增曲線。依據(jù)最低的Ct 值和最高的ΔR 值,ASFV K196R 基因探針的最佳濃度為0.2 μM。

圖2 ASFV K196R 基因引物濃度優(yōu)化

圖3 ASFV K196R 基因探針濃度優(yōu)化

2.3 ASFV 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法檢測質(zhì)粒樣品的靈敏性 選擇1.2.3.2 中測序比對結(jié)果為陽性的質(zhì)粒,經(jīng)質(zhì)粒提取,通過紫外分光光度計(jì)測定pUC57-ASFV-K196R 重組質(zhì)粒濃度,為47.05 ng/μL,純度為1.897。參照1.2.3.2 拷貝數(shù)計(jì)算公式換算pUC57-ASFV-K196R 病毒模板拷貝數(shù)為1.3×10 10 copies/μL,依次按10 的倍數(shù)倍比稀釋,取1.3×108~1.3×100copies/μL,依照優(yōu)化后的反應(yīng)體系及條件,進(jìn)行靈敏度檢驗(yàn)。結(jié)果顯示,該基因的擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)典型的S 型,各曲線間距均勻?；贙196R 基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法最低檢測量是1.3 個拷貝(圖4);而基于 K196R 基因的方法擴(kuò)增效率是101.59%,回歸方程為Y=-3.284X+37.466,R2=0.998(圖5)。

2.4 ASFV 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法的特異性檢測對偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒2 型以及豬細(xì)小病毒的全基因組DNA 和pUC57-ASFV-K196R 陽性重組質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行檢測,結(jié)果表明,只有pUC57-ASFVK196R 陽性重組質(zhì)粒可產(chǎn)生特異性熒光曲線,其余皆為陰性,證明該方法中設(shè)計(jì)的引物和探針均有著較強(qiáng)的特異性(圖6)。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法對模擬臨床樣品的檢測 對1.2.3.5 方法中建立的整合K196R 基因的細(xì)胞系,采用優(yōu)化后的反應(yīng)體系及條件,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增。如圖7 所示擴(kuò)增曲線,0.52×104copies/μL 的pUC57-ASFV-K196R 陽性重組質(zhì)粒和整合K196R 基因的細(xì)胞系,均可檢測到較強(qiáng)的熒光信號。

圖4 ASFV K196R 基因擴(kuò)增曲線

圖5 ASFV K196R 基因標(biāo)準(zhǔn)曲線

表4 陽性對照質(zhì)粒不同拷貝數(shù)的Ct 值

圖6 不同病毒ASFV K196R 基因的擴(kuò)增曲線

圖7 ASFV K196R 細(xì)胞系擴(kuò)增曲線

3 討論

ASFV 基因型多,易變異,目前無有效疫苗預(yù)防,因此防控ASFV 主要靠監(jiān)測和滅源。 國內(nèi)外已建立的多種檢測ASFV 方法中,HAD 試驗(yàn)對高效價(jià)的ASFV 可在24 h 內(nèi)得到準(zhǔn)確的檢測結(jié)果,但對于一個陰性結(jié)果的判定至少需要6 d的時(shí)間,且某些低毒力ASFV 的檢測,結(jié)果往往呈陰性[11-12],不適用于快速檢測。 ELISA 方法檢測ASFV 抗原,雖具備快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn),但對于亞急性和慢性感染豬體內(nèi)低的ASFV 載量樣本,檢測敏感性低,易出現(xiàn)假陰性結(jié)果[13]。此外,OIE 規(guī)定,涉及ASFV 活毒的HAD、ELISA等試驗(yàn)操作應(yīng)在生物安全三級實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行,實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法對滅活樣品僅需在生物安全二級實(shí)驗(yàn)室條件下即可進(jìn)行,特別適用于急性感染早期動物組織樣本、急性感染恢復(fù)期、低毒力或中等毒力感染家豬以及持續(xù)性感染的野豬和軟蜱組織樣本中ASFV 核酸的檢測[14]。

本研究比對了不同ASFV 毒株的K196R 基因序列,依據(jù)最保守的區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針,建立了ASFV TaqMan 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法,通用性好;且建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好(R2=0.998),敏感性高,最低能檢測到1.3 個拷貝/μL 的病毒核酸分子DNA。而2012 年,李洪利等檢測ASFV B646L 基因,最低能夠檢測到10 拷貝/μL 的質(zhì)粒[15];2009 年,董志珍等根據(jù)E183L基因的核苷酸序列建立了ASFV 檢測的熒光定量PCR 方法,也僅檢出15 個拷貝/μL 的樣品[16]。此外,利用本方法分別對PRV、PCV2 以及PPV等病毒的全基因組進(jìn)行特異性檢測,發(fā)現(xiàn)該方法對其他豬病毒基因組DNA 均不能產(chǎn)生特異性擴(kuò)增,說明該方法具有很好的反應(yīng)特異性。為模擬臨床樣品檢測,本研究建立了穩(wěn)定表達(dá)K196R 蛋白的細(xì)胞系,利用建立的TaqMan 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法檢測該細(xì)胞系基因組,結(jié)果呈典型的S 曲線,為該方法的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究以ASFV K196R 基因?yàn)榘袠?biāo),建立的TaqMan 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法,特異性強(qiáng),靈敏度高,對檢測樣品和環(huán)境要求相對較低,適合大批量樣品的檢測,對今后ASFV 檢測試劑盒的開發(fā)具有重要的指導(dǎo)意義。