過表達MiR-381調(diào)控LRH-1-MMP-2通路抑制卵巢癌細胞轉(zhuǎn)移的機制

李丹 李濤

(1崇州市人民醫(yī)院腫瘤科，四川 崇州 611230；2四川省腫瘤醫(yī)院)

近年來，卵巢癌在我國女性生殖系統(tǒng)腫瘤中的占比逐年升高〔1〕。卵巢癌早期無典型臨床表現(xiàn)，大多數(shù)患者就診時已處于疾病晚期，喪失了行根治性手術(shù)的機會〔2〕。對卵巢癌轉(zhuǎn)移分子機制的研究有助于提高卵巢癌患者手術(shù)切除率并改善患者長期預(yù)后。MicroRNA(miR)是單長度較短的RNA，通常其堿基數(shù)量在18～25 bp之間〔3〕。卵巢癌細胞增殖〔4〕、轉(zhuǎn)移〔5〕及血管生成〔6〕等惡性生物學過程中均證實有miR的參與。近年來研究表明，miR-381作為一種新的miR在胃癌〔7〕、結(jié)腸癌〔8〕及乳腺癌〔9〕中均表達降低，并能抑制腫瘤進展。目前，miR-381在卵巢癌中的表達水平及生物學功能尚不可知。本研究擬檢測miR-381在卵巢細胞癌中的表達情況。

1 材料和方法

1.1組織標本 選取2014年1月至2015年10月于崇州市人民醫(yī)院腫瘤科收治并行手術(shù)切除的45對卵巢癌及對應(yīng)癌旁組織(距腫瘤邊緣距離>2 cm)標本。

1.2細胞來源及主要試劑 SKVO3細胞由四川省腫瘤醫(yī)院實驗室保存；慢病毒(miR-381及陰性對照)、miR-381及U6引物分別由廣州復(fù)能基因及廣州銳博生物科技有限公司提供；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒、實時熒光定量試劑盒、 肝受體同源物(LRH)-1抗體(ab125034)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2抗體(ab97779)、β-actin抗體(ab8226)、Transwell小室及硝酸纖維素膜分別購自美國Gibco、美國Invitrogen公司、美國abcam公司、美國康寧公司和美國Millipore公司。

1.3反轉(zhuǎn)錄實時熒光定量(qRT)-PCR RNA由Trizol試劑按說明書提取。按說明分別組建RT-PCR及實時PCR體系。RT-PCR條件：50℃反轉(zhuǎn)錄30 min，94℃變性2 min，共1循環(huán)。實時PCR條件：94℃變性15 s，60℃退火30 s，68℃延伸3 min，共40循環(huán)；72℃最后延伸10 min。通過2-△△Ct法檢測miR-381的相對含量。

1.4細胞培養(yǎng)及慢病毒感染 培養(yǎng)SKVO3細胞至穩(wěn)定傳代。按過夜增殖至融合度達70%，將SKVO3細胞接種于6孔板中。過夜培養(yǎng)后洗滌細胞。慢病毒感染分組：miR-381組每孔加入1 ml的miR-381慢病毒上清液、2 ml含血清DMEM及15 μg嘌呤霉素；miR-NC組即對照組每孔加入1 ml的陰性對照慢病毒上清液、2 ml含血清DMEM及15 μg嘌呤霉素。轉(zhuǎn)染2 d后，使用特性抗生素溶液篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SKVO3細胞。

1.5劃痕愈合試驗 在6孔板中均勻接種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SKVO3細胞。100 μl的槍頭建立細胞劃痕，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗6孔板，每孔加入2 ml無血清DMEM。培養(yǎng)48 h后在顯微鏡下觀察細胞遷移情況并拍照。

1.6Transwell侵襲小室 用1×DMEM按8∶1稀釋50 mg/L的基質(zhì)膠，按100 μl每孔包被Transwell小室底膜上室面，4℃風干后放入24孔板內(nèi)。收集轉(zhuǎn)染穩(wěn)定過表達miR-381的SKVO3細胞，以無血清DMEM培養(yǎng)基重懸后調(diào)整細胞密度為1×105/ml，按250 μl每孔接種于Transwell小室上室中，24孔板內(nèi)每孔加入750 μl含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后棄去上室內(nèi)培養(yǎng)基，PBS洗滌2遍后采用4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，棉棒擦去上室面殘余細胞，在200倍顯微鏡下觀察下室面細胞并計數(shù)。

1.7裸鼠肺轉(zhuǎn)移瘤模型構(gòu)建 隨機選取BALB/c裸鼠6只，約5周齡大小，平均分為2組：miR-381組及miR-NC組。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-381及miR-NC的SKVO3細胞制備成為2.0×105/ml密度的PBS細胞懸液。每只裸鼠經(jīng)尾靜脈注射0.1 ml細胞懸液，建立腫瘤血循環(huán)轉(zhuǎn)移模型。裸鼠飼養(yǎng)4 w后處死，獲取肺組織。甲醛溶液固定后制作蘇木素-伊紅(HE)染色切片。

1.8Western印跡法檢測LRH-1蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2 檢測細胞總蛋白采用放射免疫沉淀法(RIPA)提取，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，70 V濕轉(zhuǎn)120 min轉(zhuǎn)印目標蛋白至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，封閉液室溫封閉2 h后將目標條帶分別置入相應(yīng)一抗溶液中，4℃下孵育過夜。1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗在室溫中孵育目標條帶1 h。電化學發(fā)光法顯影，自動曝光機固定條帶影像，計算蛋白相對表達量。

1.9統(tǒng)計學分析 采用SPSS13.0軟件進行χ2檢驗、成組t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1miR-381在卵巢癌組織中低表達 通過RTPCR檢測發(fā)現(xiàn)，45例卵巢癌組織中miR-381的表達水平(0.411±0.027)顯著低于癌旁組織(1.208±0.031，t=5.221，P=0.017)。

2.2miR-381抑制SKVO3細胞增殖并促進其凋亡 感染miR-381慢病毒的細胞內(nèi)miR-381表達水平(22.35±5.12)較miR-NC組(1.00±0.00)顯著升高(t=17.341，P<0.001)。劃痕愈合試驗檢測得知，過表達miR-381組剩余距離百分比為(76.28±10.89)%，miR-NC組為(48.39±8.23)%，過表達miR-38在體外顯著降低了SKVO3細胞的遷移能力(t=4.113，P=0.025)；Transwell侵襲小室試驗也表明，過表達miR-381組侵襲細胞數(shù)目〔(23.47±7.29)%〕顯著低于miR-NC組侵襲細胞數(shù)目〔(78.28±8.41)%，t=3.682，P=0.031〕。見圖1、圖2。

2.3過表達miR-381抑制裸鼠肺轉(zhuǎn)移瘤形成 過表達miR-381后SKVO3細胞在裸鼠肺臟中形成的腫瘤結(jié)節(jié)的面積〔(16.43±5.44)mm2〕顯著低于miR-NC組〔(41.03±17.39)mm2，t=3.327，P=0.039〕。見圖3。

圖1 過表達miR-381抑制卵巢癌SKV03細胞遷移(×200)

圖2 過表達miR-381抑制SKVO3細胞侵襲(結(jié)晶紫染色，×200)

圖3 過表達miR-381表達對SKVO3細胞裸鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)形成的影響(HE，×100)

2.4過表達miR-381抑制SKVO3細胞中LRH-1及下游靶點MMP-2的表達 與miR-NC組相比，過表達miR-381的SKVO3細胞內(nèi)LRH-1 mRNA及蛋白水平均顯著降低(P<0.05、P<0.01)，LRH-1下游效應(yīng)基因MMP-2蛋白的表達也明顯下調(diào)(P<0.05)。提示miR-381可能是通過下調(diào)LRH-1/MMP-2的表達來發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。見圖4、表1。

圖4 過表達miR-381下調(diào)LRH-1、MMP-2蛋白表達

表1 過表達miR-381對SKVO3細胞內(nèi)LRH-1及MMP-2表達的影響

3 討 論

miR-381在不同類型的惡性腫瘤中的表達趨勢并不一致。本研究說明miR-381在卵巢癌中可能是一種抑癌因子。通過實驗證實，miR-381在體外培養(yǎng)細胞和機體內(nèi)環(huán)境中均具有一定的抑制腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用。除此之外，有研究指出，miR-381也能夠抑制癌細胞活性和增殖能力，最終削弱癌細胞的生長〔10〕。

靶向結(jié)合目的基因mRNA的3'-非翻譯區(qū)是miR發(fā)揮負向表達調(diào)控作用的經(jīng)典機制。通過檢索分析發(fā)現(xiàn)，LRH-1的mRNA存在miR-381的結(jié)合位點〔11〕。既往研究也表明LRH-1高表達是卵巢癌進展的促進因素〔12,13〕。本文顯示過表達miR-381在體外的確能下調(diào)LRH-1的表達水平。在多種疾病模型中的研究結(jié)果表明LRH-1能夠調(diào)節(jié)包括Wnt/β-catenin在內(nèi)的多條信號通路而影響細胞的生物學特性〔14〕。研究表明，與腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的MMP-2也是LRH-1的下游效應(yīng)分子之一〔15〕。在本研究提示miR-381抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用最終可能是通過下調(diào)MMP-2表達而實現(xiàn)的。

綜上，miR-381在卵巢癌中低表達，上調(diào)miR-381可能通過抑制LRH-1、MMP-2的表達而抑制卵巢細胞癌轉(zhuǎn)移。