長鏈非編碼RNAs XIST通過靶向miR-377-3p調(diào)節(jié)肝癌細胞增殖、凋亡的機制

周明龍 宋安洋

(山東東營勝利石油管理局勝利醫(yī)院老年病科，山東 東營 257055)

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，有發(fā)病率高、侵襲性強、進展速度快等特點，手術(shù)切除、放化療、肝移植等是其主要治療手段，但患者5年生存率仍然很低，嚴重威脅患者的生命健康〔1〕。研究表明，肝癌發(fā)生發(fā)展伴隨多種分子及信號通路異常〔2〕，因此，從分子水平研究肝癌發(fā)生發(fā)展機制，并將特異性分子作為治療靶點，對于肝癌診療有重要意義。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度大于200 nt的非編碼RNA(ncRNA)分子，可在表觀遺傳水平、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達，從而廣泛參與機體生理及病理過程〔3〕。有研究表明，lncRNA異常表達與肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔4〕。lncRNA 染色體失活特異轉(zhuǎn)錄本(XIST)是XIST基因的一類產(chǎn)物，有相當多研究證實，XIST與多種人類癌癥的發(fā)生有關(guān)，可促進肝癌進展〔5〕。微小RNA(microRNA或miRNA)是一類長18～22 nt的非編碼小分子RNA，可通過與靶基因mRNA 3′非翻譯區(qū)(UTR)特異性結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達，已有大量研究表明miRNA異常表達與肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔6〕。miR-377-3p是miRNA大家族成員之一，是新近發(fā)現(xiàn)的一個在多種腫瘤中有生長抑制效應的miRNA〔7〕。肝癌中miR-377-3p研究較少，有研究顯示，miRNA-377在肝癌中表達明顯下調(diào)，其靶基因SMYD3表達上調(diào)，miRNA-377表達下調(diào)可降低對SMYD3表達的抑制，可能是肝癌發(fā)生的重要機制〔8〕。lncRNA XIST是否可調(diào)節(jié)miR-377-3p影響肝癌細胞生長還未明確。本研究旨在探討lncRNA XIST靶向調(diào)控miR-377-3p對肝癌細胞活力和凋亡的影響。

1 材料方法

1.1試劑和儀器 人肝癌HepG2細胞株購自美國ATCC。杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、磷酸鹽緩沖液(FBS)均購自美國Gibco；Trizol、Lipofectamine 2000試劑盒均購自美國Invitrogen；細胞增殖-毒性檢測(CCK)-8試劑盒購自日本同仁化學研究所(Dojindo)；熒光素酶活性檢測試劑盒及熒光素酶報告載體均購自美國Promega；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TAKARA；細胞凋亡試劑盒購自南京凱基；β-catenin、cyclinD1和Bax抗體均購自美國CST；實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)儀、酶標儀購自美國Thermo；流式細胞儀購自美國BD；紫外分光光度計購自美國NanoDrop。

1.2細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 HepG2細胞用含10% FBS的DMEM，在5%體積分數(shù)CO2、37℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每1～2 d換液一次，細胞達80%～90%生長融合時，胰酶消化后傳代。按照Lipofectamine(Lipo)2000說明書進行轉(zhuǎn)染。具體操作步驟如下：轉(zhuǎn)染前1 d，以合適的密度接種生長至對數(shù)期的HepG2細胞于6孔板，使轉(zhuǎn)染前細胞達70%～90%生長匯合度，使用Opti-MEM培養(yǎng)基分別稀釋Lipo2000、XIST特異性siRNA(si-XIST)、pcDNA3.1-XIST(轉(zhuǎn)染XIST過表達載體)、si-XIST+anti-miR-377-3p(同時抑制XIST和miR-377-3p表達)及相應的對照，將稀釋后的si-XIST、pcDNA3.1-XIST及si-XIST+anti-miR-377-3p分別與Lipo2000按照1∶1比例混勻，制備成復合物，室溫孵育5 min，將復合物加入6孔板相應孔內(nèi)，輕搖混勻，在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育6 h，更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率 Trizol法提取細胞總RNA，紫外吸收測定法檢測提取的RNA濃度和純度，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明的體系和條件將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參基因，設置20 μl反應體系，實時熒光定量PCR進行擴增。反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)。采用2-△△Ct方法計算XIST和miR-377-3p mRNA相對表達量。每組設置6個復孔，實驗重復3次。

1.4CCK-8法檢測細胞活力 轉(zhuǎn)染前24 h，以5×103個/孔接種生長至對數(shù)期的HepG2細胞于96孔板，按照1.2方法轉(zhuǎn)染si-XIST和si-XIST+anti-miR-377-3p，分別在轉(zhuǎn)染的24、48、72 h，避光條件下在每孔中加入10 μl CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，酶標儀測定450 nm波長下各孔的吸光度值(A)。每組設置5個復孔，實驗重復3次，以所得均值，繪制生長曲線。

1.5流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 轉(zhuǎn)染前24 h，以2×105個/孔接種生長至對數(shù)期的HepG2細胞于6孔板，按照1.2方法轉(zhuǎn)染si-XIST和si-XIST+anti-miR-377-3p，轉(zhuǎn)染48 h，收集細胞，預冷PBS洗滌細胞，1×結(jié)合緩沖液重懸細胞為1×106/ml濃度細胞懸液，取100 μl細胞懸液至流式管中，避光條件下分別加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，混勻后在避光條件下室溫孵育15 min，孵育結(jié)束，每管加400 μl 1×結(jié)合緩沖液，混勻后，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡率(1 h)。實驗重復3次。

1.6雙熒光素酶報告實驗 靶基因預測軟件顯示XIST種子區(qū)域與miR-377-3p 3′ UTR端存在部分堿基互補性，構(gòu)建野生型(WT)和突變型(MUT) XIST載體，與miR-377-3p mimics共轉(zhuǎn)染進HepG2細胞，通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測雙熒光素酶活性。

1.7Western印跡 適量細胞裂解液提取總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒定量蛋白。蛋白與上樣緩沖液等量混勻，100℃變性5 min，每孔道上樣等量蛋白，經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，膜用5%脫脂奶粉封閉1 h，洗膜，加稀釋的鼠抗人β-catenin、cyclinD1和Bax抗體(1∶1 000)，4℃孵育過夜，洗膜，加辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠二抗，37℃搖床震蕩封閉1 h，洗膜，電化學發(fā)光(ECL)顯色。Quantity One軟件進行灰度值分析。實驗重復3次。

1.8計學方法 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗，方差分析及SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1抑制XIST表達對HepG2細胞活力的影響 qRT-PCR檢測si-XIST轉(zhuǎn)染48 h后HepG2細胞XIST mRNA表達，結(jié)果顯示，si-XIST組XIST mRNA表達明顯低于對照組(0.252±0.031 vs 1.000±0.012，P<0.05)。si-XIST轉(zhuǎn)染HepG2細胞72 h，通過CCK-8法檢測細胞活力，結(jié)果顯示，si-XIST轉(zhuǎn)染HepG2細胞24～72 h的細胞活力均明顯低于對照組(P<0.05)。見圖1，表1。

2.2抑制XIST表達對HepG2細胞凋亡的影響 si-XIST轉(zhuǎn)染HepG2細胞48 h，通過流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，si-XIST組細胞凋亡率明顯高于對照組〔(27.83±1.65)% vs(2.46±0.25)%，P<0.05〕。見圖2。

圖1 CCK-8檢測抑制XIST表達對HepG2細胞活力影響

表1 抑制XIST表達對HepG2細胞活力影響

圖2 流式細胞術(shù)檢測抑制XIST表達后HepG2細胞凋亡率

2.3靶基因預測 生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，XIST和miR-377-3p有可結(jié)合的位點，見圖3。雙熒光素酶報告實驗表明，si-XIST(WT)與miR-377-3p mimics共轉(zhuǎn)染HepG2細胞后，熒光素酶活性明顯升高，pcDNA3.1-XIST(WT)與miR-377-3p mimics共轉(zhuǎn)染HepG2細胞后，熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)。si-XIST(MUT)或pcDNA3.1-XIST(MUT)與miR-377-3p mimics共轉(zhuǎn)染HepG2細胞后，熒光素酶活性均無明顯變化(P>0.05)。見表2。si-XIST可明顯上調(diào)HepG2細胞miR-377-3p mRNA表達(6.483±0.062 vs 1.000±0.010)，pcDNA3.1-XIST可明顯下調(diào)HepG2細胞miR-377-3p mRNA表達(0.218±0.025 vs 1.000±0.015，P<0.05)。說明XIST和miR-377-3p存在靶向關(guān)系。

2.4抑制miR-377-3p可逆轉(zhuǎn)XIST對HepG2細胞活力和凋亡的影響 anti-miR-377-3p轉(zhuǎn)染HepG2細胞，miR-377-3p mRNA表達明顯降低(0.265±0.031 vs 1.000±0.016，P<0.05)。抑制miR-377-3p表達可明顯減低XIST對HepG2細胞活力抑制和凋亡促進作用(P<0.05)。見圖4，表3。

圖3 熒光素酶報告基因檢測miR-377-3p是XIST的直接靶點

表2 WT/MUT的XIST 3′UTR與miR-377-3p共轉(zhuǎn)染HepG2細胞后熒光素酶活性

與si-XIST組或pcDNA3.1組比較:1)P<0.05

A:CCK-8法檢測各組細胞活力；B:流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡率圖4 XIST靶向miR-377-3p對HepG2細胞活力和凋亡的影響

表3 XIST靶向miR-377-3p對HepG2細胞活力和凋亡的影響

與對照組比較:1)P<0.05；與si-XIST組比較:2)P<0.05，下表同

2.5抑制miR-377-3p可逆轉(zhuǎn)XIST對HepG2細胞Wnt/β-catenin信號通路影響 si-XIST可明顯下調(diào)β-catenin和cyclinD1蛋白表達，上調(diào)Bax蛋白表達，而抑制miR-377-3p可減弱si-XIST對β-catenin、cyclinD1和Bax表達影響(P<0.05)。見圖5，表4。

1：對照組；2：si-XIST組；3：si-XIST+anti-miR-377-3p；圖5 XIST靶向miR-377-3p對HepG2細胞Wnt/β-catenin信號通路影響

表4 β-catenin、cyclinD1和Bax的蛋白相對表達量

3 討 論

lncRNA和miRNA均屬于ncRNA，近些年來miRNA成為研究熱點，已有大量研究表明，miRNA在腫瘤、免疫等多方面均發(fā)揮重要作用〔9〕。lncRNA雖然一直被認為是轉(zhuǎn)錄的“噪音”，且無功能，但最近多項研究表明，lncRNA在包括腫瘤在內(nèi)的多個方面發(fā)揮重要作用，且lncRNA和miRNA可相互，影響腫瘤發(fā)生發(fā)展〔10〕。XIST在X染色體失活過程發(fā)揮重要作用，近些年來越來越多研究表明，XIST與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。如敲除膠質(zhì)母細胞瘤XIST表達，可明顯抑制細胞增殖、侵襲和遷移能力，并誘導細胞凋亡〔11〕；上調(diào)XIST可促進骨肉瘤細胞增殖〔12〕。以上研究提示XIST在腫瘤中的重要作用。過表達XIST可促進肝癌生長〔5〕，但其機制尚未明確。本研究將XIST特異性性siRNA轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細胞，發(fā)現(xiàn)抑制XIST表達可明顯降低HepG2細胞活力和誘導細胞凋亡。這與既往研究〔11，12〕一致。

在肝癌中XIST是否可與特定miRNA互作，影響肝癌細胞生長，還未明確。因此，我們通過生物信息學分析及上調(diào)和下調(diào)XIST表達后miR-377-3p表達檢測，證實XIST和miR-377-3p存在靶向關(guān)系。miR-377-3p是新近發(fā)現(xiàn)的一個與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病發(fā)生有關(guān)的miRNA。有研究顯示，前列腺癌中miR-377-3p呈現(xiàn)低表達，miR-377-3p可明顯抑制癌細胞增殖能力，促進細胞凋亡〔13〕；miR-377-3p 可通過上調(diào)糖原合成激酶(GSK)-3β表達和激活核因子(NF)-κB信號促進結(jié)直腸癌進展〔14〕。以上研究提示miR-377-3p可能與肝癌細胞生長有關(guān)。已有研究表明，miRNA-377在肝癌中表達明顯下調(diào)〔8〕。為了驗證XIST是否可靶向調(diào)節(jié)miR-377-3p影響HepG2細胞生長。將anti-miR-377-3p及si-XIST同時轉(zhuǎn)染HepG2細胞，發(fā)現(xiàn)抑制miR-377-3p可明顯減弱XIST對HepG2細胞活力抑制和凋亡促進作用。本研究結(jié)果提示XIST可通過上調(diào)miR-377-3p抑制肝癌細胞生長。

Wnt/β-catenin信號通路是Wnt信號通路中經(jīng)典信號途徑，在多種腫瘤中處于激活狀態(tài)，其激活可促進腫瘤進展〔15,16〕。已有研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號通路主要通過調(diào)節(jié)下游靶基因影響肝癌發(fā)生發(fā)展〔17〕。目前發(fā)現(xiàn)Wnt信號通路的靶基因有β-catenin、cyclinD1、Bax等。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)鍵分子，多項研究表明在肝癌再生中β-catenin表達明顯升高，而抑制β-catenin表達可明顯降低肝癌細胞生長〔18〕。cyclinD1為一個細胞周期因子，與肝癌發(fā)生、進展及預后密切相關(guān)〔19〕。Bax是Bcl-2家族成員之一，發(fā)揮促凋亡作用，肝癌中上調(diào)Bax表達可明顯誘導癌細胞凋亡〔20〕。有研究顯示，XIST可通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路影響多種癌細胞生長〔21〕。本研究結(jié)果提示XIST可通過調(diào)節(jié)miR-377-3p抑制Wnt/β-catenin信號通路影響肝癌細胞生長。