miR-194-5p靶向MEX3A調(diào)控肝癌細(xì)胞活性和凋亡的機(jī)制

劉占偉 祖恩霞 潘躍銀 石明宏

(1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立臨床學(xué)院腫瘤內(nèi)科，安徽 淮南 230001；2安徽理工大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科；3安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院腫瘤內(nèi)科；4安徽理工大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤放療科)

微小RNA(miRNA)是由19～23 nt組成的短鏈非編碼RNA小分子，與人類(lèi)多種疾病的發(fā)生有關(guān)〔1〕。目前發(fā)現(xiàn)，30%～90 %的人類(lèi)基因是由miRNA調(diào)控的，其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)十分復(fù)雜〔2〕。miR-194-5p在很多癌癥中均有報(bào)道〔3〕，但其在肝癌中的報(bào)道甚少。MEX3A屬于人類(lèi) MEX3家族的一員，與MEX3B、MEX3C、MEX3D是同源基因，該家族基因具有高度保守的KH結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域可結(jié)合RNA和ssRNA，參與蛋白的DNA轉(zhuǎn)錄及mRNA翻譯〔4，5〕。有研究報(bào)道，MEX3A在膀胱癌、胃癌中表達(dá)〔6，7〕，但其在肝癌中的表達(dá)尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以肝癌細(xì)胞HepG2為研究對(duì)象，檢測(cè)HepG2細(xì)胞中miR-194-5p、MEX3A的表達(dá)，觀察過(guò)表達(dá)miR-194-5p、敲減MEX3A、過(guò)表達(dá)MEX3A對(duì)HepG2細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人肝癌細(xì)胞HepG2、正常肝細(xì)胞L02均購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心(ATCC)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、噻唑藍(lán)(MTT)試劑、胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；LipofectamineTM2000、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自大連Takara公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜購(gòu)自德國(guó)羅氏診斷有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒、電化學(xué)發(fā)光(ECL)發(fā)光液和RIPA蛋白裂解液均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將HepG2、L02細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640/DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度約75%，用胰蛋白酶消化1 min，按照1∶3的比例更換培養(yǎng)基，每2 d傳代1次。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將miR-194-5p mimics、miR-NC、si-MEX3A、si-con、miR-194-5p+pcDNA-MEX3A、miR-194-5p+pcDNA按照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū)操作步驟轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞，分別標(biāo)記為miR-194-5p 組、miR-NC組、si-MEX3A組、si-con組、miR-194-5p+pcDNA-MEX3A組、miR-194-5p+pcDNA組，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，用qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染成功后，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3qRT-PCR實(shí)驗(yàn) 取適量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期1.2.2各組細(xì)胞，遵照RNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)要求提取RNA，進(jìn)行定量，然后按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA。最后按qRT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)miR-194-5p、MEX3A。采用2-△△Ct計(jì)算miR-194-5p、MEX3A的表達(dá)。

1.2.4Western印跡實(shí)驗(yàn) 收集1.2.2各組細(xì)胞，加入裂解液，冰上裂解30 min。12 000 r/min離心10 min。取上清置于EP管，加入5倍SDS上樣緩沖液，沸水煮沸10 min。電泳后用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂奶粉將膜封閉2 h，洗膜，加入Ⅰ抗，4℃過(guò)夜孵育，洗膜，加Ⅱ抗，4℃ 2 h。加發(fā)光液，曝光。

1.2.5MTT實(shí)驗(yàn) 取適量1.2.2各組細(xì)胞，加入20 μl 5 g/L的MTT溶液，培養(yǎng)4 h，然后棄去上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，震蕩，使結(jié)晶溶解，在490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)細(xì)胞吸光度(A)。細(xì)胞的活力與細(xì)胞的OD值呈正比。

1.2.6Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn) 用結(jié)合緩沖液 500 μl 懸浮1.2.2各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，分別加入5 μl的 Annexin V-/FITC和PI，混勻，室溫避光靜置15 min。采用流式細(xì)胞儀分析測(cè)定結(jié)果。細(xì)胞的凋亡率(%)=早期凋亡率+晚期凋亡率。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.2.7雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 構(gòu)建WT-MEX3A(含MEX3A 3'UTR片段)和MUT-MEX3A(含MEX3A 3'UTR片段突變體)的熒光素酶報(bào)告載體，采用LipofectamineTM2000分別將WT-MEX3A和MUT-MEX3A與miR-194-5p mimics、miR-NC共轉(zhuǎn)染，分別標(biāo)記為miR-194-5p 組、miR-NC組,轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h，按雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒技術(shù)手冊(cè)操作，記錄螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶激發(fā)值，以?xún)烧叩谋戎翟u(píng)價(jià)MEX3A基因的激活程度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件，計(jì)量資料多組間比較采用單因素方差分析，兩組比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-194-5p和MEX3A在肝癌HepG2細(xì)胞和正常肝細(xì)胞L02中的表達(dá) 與L02組相比，HepG2組細(xì)胞中miR-194-5p表達(dá)顯著降低，MEX3A mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖1，表1。

圖1 MEX3A蛋白表達(dá)

2.2過(guò)表達(dá)miR-194-5p對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響 與miR-NC組相比，miR-194-5p組HepG2細(xì)胞中miR-194-5p表達(dá)顯著升高，48、72 h時(shí)細(xì)胞活性顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表1 miR-194-5p和MEX3A在肝癌HepG2細(xì)胞和正常肝細(xì)胞L02中的表達(dá)

表2 過(guò)表達(dá)miR-194-5p對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響

2.3過(guò)表達(dá)miR-194-5p對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響 與miR-NC組〔(6.79±0.71)%〕相比，miR-194-5p組HepG2細(xì)胞凋亡率〔(18.34±1.22)%〕顯著升高(t=14.172,P=0.000)。

2.4抑制MEX3A表達(dá)對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與si-NC組相比，si-MEX3A組HepG2細(xì)胞中MEX3A表達(dá)顯著降低(圖2)，48、72 h時(shí)細(xì)胞活性顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表3。

圖2 MEX3A蛋白表達(dá)

表3 抑制MEX3A表達(dá)對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.5miR-194-5p靶向調(diào)控MEX3A的表達(dá) 運(yùn)用miRcode數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)到miR-194-5p與MEX3A 3'UTR存在結(jié)合位點(diǎn)(圖3)。雙熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，與miR-NC組(1.01±0.09)相比，miR-194-5p組WT-MEX3A細(xì)胞中熒光活性(0.39±0.04)顯著降低(t=10.904,P=0.000)，MUT-MEX3A細(xì)胞中熒光活性不受影響(miR-NC組：0.97±0.08，miR-194-5p組：0.99±0.07；t=0.326，P=0.761)。與miR-NC組(0.51±0.05)相比，miR-194-5p組細(xì)胞中MEX3A表達(dá)(0.19±0.03)顯著降低；與anti-miR-NC組(0.48±0.04)相比，anti-miR-194-5p組細(xì)胞中MEX3A表達(dá)(0.82±0.07)顯著升高，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

2.6MEX3A過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了過(guò)表達(dá)miR-194-5p對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖和凋亡的作用 與miR-NC組相比，miR-194-5p組HepG2細(xì)胞中MEX3A表達(dá)顯著降低；48、72 h時(shí)細(xì)胞活性顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高；與miR-194-5p+pcDNA組相比，miR-194-5p+pcDNA-MEX3A組HepG2細(xì)胞中MEX3A表達(dá)顯著升高，48、72 h時(shí)細(xì)胞活性顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖5，表4。

圖3 MEX3A的3’UTR中含有與miR-194-5p互補(bǔ)的核苷酸序列

1～4分別為：miR-NC組，miR-194-5p組，anti-miR-NC組，anti-miR-194-5p組圖4 各組MEX3A蛋白表達(dá)

1～4分別為：miR-NC組，miR-194-5p組，miR-194-5p+pcDNA組，miR-194-5p+pcDNA-MEX3A圖5 MEX3A蛋白表達(dá)

表4 MEX3A過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了過(guò)表達(dá)miR-194-5p對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖和凋亡的作用

與miR-NC組比較：1)P<0.05；與miR-194-5p+pcDNA組比較：2)P<0.05

3 討 論

miRNA在癌癥中的調(diào)控作用已得到普遍認(rèn)可〔6〕。同一個(gè)miRNA在不同癌癥中可能發(fā)揮不同的作用，同一個(gè)miRNA在同一個(gè)組織中的不同生長(zhǎng)期(胚胎期、成熟期)或癌癥和疾病的不同階段的表達(dá)也是不同的〔7,8〕，但miR-194-5p在肝癌中的研究甚少。卓麗娟等〔9〕通過(guò)miRNA芯片檢測(cè)肝癌細(xì)胞中的差異表達(dá)miRNA中發(fā)現(xiàn)，miR-194的表達(dá)出現(xiàn)異常升高。Kong等〔10〕研究報(bào)道，miR-194-5p在肝癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)均出現(xiàn)異常降低，并且通過(guò)CCK8法和克隆形成實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證過(guò)表達(dá)miR-194-5p可抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。本研究運(yùn)用qRT-PCR、Western印跡檢測(cè)了HepG2細(xì)胞中miR-194-5p的表達(dá)，結(jié)果與Kong等〔10〕的結(jié)果一致，但與卓麗娟等〔9〕的發(fā)現(xiàn)相悖。這為miR-194-5p的功能研究提供了參考，也為肝癌中miR-194-5p的研究提供了理論依據(jù)。進(jìn)一步研究，通過(guò)MTT法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了HepG2細(xì)胞的活性和凋亡，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-194-5p可抑制HepG2細(xì)胞的活性并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示miR-194-5p在肝癌中的潛在治療作用。通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-194-5p與MEX3A存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)，又運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了miR-194-5p靶向MEX3A，且miR-194-5p可負(fù)向調(diào)控MEX3A的表達(dá)。

最新研究發(fā)現(xiàn)，MEX3A和MEX3B同為細(xì)胞質(zhì)處理小體(P小體)的重要組成部分，主要參與mRNA的降解或抑制〔11,12〕。外國(guó)學(xué)者報(bào)道，MEX3可能通過(guò)泛素化參與了mRNA的調(diào)控〔13〕。MEX3A參與機(jī)體多種疾病的進(jìn)展，包括癌癥，但其在肝癌中的作用研究很少。Jiang等〔14〕在胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)，敲除MEX3A可抑制胃癌細(xì)胞的集落形成、遷移和侵襲，并在體內(nèi)可抑制腫瘤的生長(zhǎng)，MEX3A在癌組織和胃癌細(xì)胞中的表達(dá)均出現(xiàn)明顯的升高。Pereira等〔15〕、Krepischi等〔16〕的研究均提示MEX3A為致癌基因，但并未繼續(xù)深入研究其對(duì)癌細(xì)胞表型的影響。房超等〔17～19〕的系列研究顯示，下調(diào)MEX3A在膀胱癌中的表達(dá)可抑制膀胱癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抑制膀胱癌細(xì)胞進(jìn)一步惡化的治療作用。本研究檢測(cè)了肝癌細(xì)胞HepG2中MEX3A的表達(dá)，結(jié)果顯示，MEX3A在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于正常肝細(xì)胞L02中的表達(dá)，這是國(guó)內(nèi)外首次發(fā)現(xiàn)MEX3A在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)。但本研究的不足之處在于未在肝癌組織中檢測(cè)MEX3A的表達(dá)，不能更充分地證明MEX3A在肝癌中的作用。這也為后續(xù)研究MEX3A在肝癌中的潛在治療價(jià)值提供了理論依據(jù)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，敲減MEX3A可抑制HepG2細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡，這預(yù)示著抑制MEX3A可在肝癌中發(fā)揮治療作用。過(guò)表達(dá)MEX3A具有與敲減MEX3A相反的作用，甚至可以逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)miR-194-5p對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用，這部分結(jié)果在一定程度上可驗(yàn)證miR-194-5p與MEX3A之間的靶向調(diào)節(jié)關(guān)系，更重要的是，為miR-194-5p、MEX3A在肝癌中的作用機(jī)制研究及臨床治療價(jià)值探討奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

綜上所述，miR-194-5p可抑制肝癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)凋亡，其機(jī)制可能與靶向MEX3A有關(guān)，為肝癌精準(zhǔn)治療的研究及應(yīng)用提供參考。