地榆對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡及炎癥因子表達(dá)的影響

劉維 楊譽(yù)佳 袁利

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦科，貴州 遵義 563003)

子宮內(nèi)膜癌是常見(jiàn)的婦科生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，好發(fā)于更年期和絕經(jīng)期婦女，其發(fā)病與生活方式密切相關(guān)，隨著生活環(huán)境、生活習(xí)慣的改變，子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率正逐年上升〔1〕。對(duì)子宮內(nèi)膜癌治療方法早期以手術(shù)治療為主，晚期以放療、化療為主，這些治療方法對(duì)患者造成極大的傷害〔2〕。近年來(lái)，由于中藥治療、分子靶向治療和激素治療方法創(chuàng)傷小、效果佳，成為很多科研學(xué)者的研究熱點(diǎn)〔3，4〕。地榆是一種常見(jiàn)的中藥止血?jiǎng)?，具有止血、消炎、減少水腫、防止感染等作用，臨床上地榆用于子宮肌瘤、宮頸癌等婦科疾病的治療〔5〕。最近研究發(fā)現(xiàn)，地榆可使肝癌、胃癌、肺癌、宮頸癌等癌細(xì)胞在形態(tài)上發(fā)生皺縮、破裂、脫壁等變化，可不同程度地抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)〔6〕。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和發(fā)展與炎癥密切相關(guān)，一些炎癥因子、炎癥細(xì)胞、趨化因子存在于子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞和局部組織中〔7，8〕。炎癥可通過(guò)各種炎癥細(xì)胞、炎癥因子誘導(dǎo)炎癥通路促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖和遷移，一些促炎細(xì)胞因子可抑制細(xì)胞凋亡，刺激更多的促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，反饋性調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡〔9，10〕。因此，抑制炎癥因子阻礙炎癥通路可成為干預(yù)子宮內(nèi)膜癌發(fā)生和發(fā)展的一種措施。本研究通過(guò)體外分離培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞，探討地榆對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡和炎癥因子表達(dá)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 細(xì)胞來(lái)源：子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B細(xì)胞株(上海斯信生物科技有限公司)；藥材：地榆提取液(西安金綠生物工程技術(shù)有限公司)。試劑：Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶、杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)(美國(guó)Sigma公司)；胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；噻唑藍(lán)(MTT)試劑(廣州朗日生物技術(shù)有限公司)；膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡試劑盒(江蘇凱基生物公司)；白細(xì)胞介素(IL)-1β酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒、IL-8 ELISA檢測(cè)試劑盒、腫瘤壞死因子(TNF)-α ELISA檢測(cè)試劑盒(上海晶天生物科技公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(美國(guó)Thermo公司)；剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase)-3抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體(美國(guó)Abcam公司)。

1.2子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的培養(yǎng) 在無(wú)菌條件下取子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B細(xì)胞，培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合度約為80%時(shí)，加入Ⅱ型膠原酶和胰蛋白酶消化傳代，2～4 d傳代一次，收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞分組 對(duì)子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B細(xì)胞進(jìn)行分組，用含有地榆提取液終濃度為0.00 mg/ml培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞為對(duì)照組。用含有地榆提取液終濃度為0.25、1.00、4.00 mg/ml培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞分別為低、中、高濃度組。

1.4MTT檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率 取子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞，接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，按照對(duì)照組、低濃度組、中濃度組和高濃度組方法處理細(xì)胞，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后，加入50 μl的0.5 mg/ml的MTT溶液到每孔細(xì)胞中，37℃孵育4 h，除去上清液后加入100 μl二甲基亞砜溶液，緩慢震蕩反應(yīng)10 min，待結(jié)晶物溶化后，在490 nm處檢測(cè)各孔光密度(OD)值。以對(duì)照組測(cè)得A值為對(duì)照計(jì)算生長(zhǎng)抑制率，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)。

1.5流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡 取各組細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為106個(gè)/ml細(xì)胞，收集1 ml細(xì)胞，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次后，加入400 μl的結(jié)合緩沖液混合，再依次加入10 μl的PI和5 μl的Annexin V-FITC，放在室溫下避光孵育5 min后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡情況。

1.6Western印跡測(cè)定Cleaved Caspase-3和Bax的表達(dá)水平 收集各組培養(yǎng)48 h后的細(xì)胞，預(yù)冷的PBS漂洗后加入50 μl細(xì)胞裂解液，置于冰上充分裂解30 min后，用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下，轉(zhuǎn)移至EP管中，4℃，12 000 r/min離心10 min，吸取蛋白上清至另一EP管中，用BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。配制十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠，12%的分離膠和5%的濃縮膠。將蛋白樣品與5×上樣緩沖液按照4∶1的比例混合煮沸反應(yīng)10 min，將煮沸過(guò)的混合液加入上樣孔中，每孔加入30 μl的樣品。用60 V電壓電泳跑濃縮膠，待樣品進(jìn)入分離膠和濃縮膠邊緣時(shí)，調(diào)整電壓為120 V跑分離膠。將蛋白在300 mA恒流下條件下轉(zhuǎn)印120 min至硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，放置在5%脫脂奶粉溶液中，室溫孵育90 min，加入500倍稀釋的一抗在4℃孵育過(guò)夜，用Tween-20 Tris-鹽酸緩沖液(TBST)洗滌后加入1 000倍稀釋的二抗在室溫下孵育90 min，用TBST洗滌后，轉(zhuǎn)移到暗室中，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光，以β-actin為內(nèi)參，分析Cleaved Caspase-3和Bax的蛋白表達(dá)水平。

1.7ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-1β、IL-8、TNF-α含量 取各組子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，分別收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，用ELISA法分別檢測(cè)上清液中IL-1β、IL-8、TNF-α含量，步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，縱坐標(biāo)是標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值，橫坐標(biāo)是濃度，計(jì)算實(shí)驗(yàn)各孔檢測(cè)指標(biāo)的含量。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析，組間LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1地榆對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的影響 與對(duì)照組 〔(0.00±0.00)%〕相比，低濃度組〔(8.41±0.65)%〕、中濃度組〔(35.83±3.56)%〕、高濃度組細(xì)胞抑制率〔(67.87±7.13)%〕均明顯增加，中濃度組高于低濃度組，高濃度組高于中濃度組和低濃度組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著地榆濃度的增加抑制率逐步升高，具有濃度依賴(lài)關(guān)系。

2.2地榆對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組〔(9.95±1.13)%〕相比，低濃度組、中濃度組、高濃度組的凋亡率〔(23.91±2.57)%、(39.42±4.48)%、(58.44±5.89)%〕顯著升高，中濃度組高于低濃度組，高濃度組高于中濃度組和低濃度組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。這說(shuō)明地榆可呈濃度依賴(lài)性地促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡。

圖1 地榆作用48 h后各組細(xì)胞凋亡

2.3Western印跡測(cè)定細(xì)胞中Cleaved Caspase-3和Bax的表達(dá) 與對(duì)照組相比，低濃度組、中濃度組、高濃度組Cleaved Caspase-3和Bax的蛋白表達(dá)水平均有所上調(diào)，其中中濃度組Cleaved Caspase-3和Bax的蛋白表達(dá)水平上調(diào)幅度高于低濃度組，高濃度組Cleaved Caspase-3和Bax的蛋白表達(dá)水平上調(diào)幅度高于中、低濃度組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2和表1。這說(shuō)明地榆可通過(guò)凋亡相關(guān)蛋白的上調(diào)促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡。

圖2 Western印跡檢測(cè)各組細(xì)胞Cleaved Caspase-3、Bax蛋白水平

表1 各組細(xì)胞Cleaved Caspase-3、Bax蛋白水平比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與低濃度組比較：2)P<0.05；與中濃度組比較：3)P<0.05；表2同

2.4地榆對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-8、TNF-α的影響 低濃度組、中濃度組、高濃度組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-8、TNF-α的含量均低于對(duì)照組，且隨著地榆濃度的升高，細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-1β、IL-8、TNF-α的含量降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。這提示地榆可以抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞炎癥因子IL-1β、IL-8、TNF-α的表達(dá)。

表2 各組細(xì)胞中IL-1β、IL-8、TNF-α含量

3 討 論

隨著生活水平的提高、科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們的思想觀念也逐步發(fā)生改變，從追求治愈到提高腫瘤患者的生存質(zhì)量〔11〕。因此，尋找安全有效、副作用較小的治療措施的研究備受關(guān)注，近年來(lái)利用中藥預(yù)防子宮內(nèi)膜癌成為研究的熱點(diǎn)。一些中藥可促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的凋亡〔12〕。地榆是薔薇科地榆屬多年生草本植物的中草藥，具有涼血止血、抗菌消炎、抗氧化、抗過(guò)敏等作用。目前已有研究報(bào)道地榆可通過(guò)抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡達(dá)到抗腫瘤的作用〔13〕。有報(bào)道證實(shí)，地榆皂苷類(lèi)化合物可顯著抑制甲狀腺乳頭癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且呈劑量依賴(lài)性〔14〕。地榆可有效抑制人子宮頸癌細(xì)胞JTC-26、宮頸癌細(xì)胞Hela的生長(zhǎng)〔5〕。本研究說(shuō)明地榆可以抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，具有抗癌作用，與上述報(bào)道類(lèi)似。

促凋亡蛋白Bax是線粒體通路激活的關(guān)鍵分子，Bax參與細(xì)胞色素C從線粒體中釋放，線粒體膜電位的改變及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子濃度的調(diào)節(jié)，還可激活Caspase蛋白酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，啟動(dòng)線粒體通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔15〕。從雷公藤中提取的主要活性物質(zhì)雷公藤甲素可抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖，且呈現(xiàn)一定劑量依賴(lài)性，還可上調(diào)Caspase-3的表達(dá)，通過(guò)激活依賴(lài)Caspase的線粒體凋亡途徑促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的凋亡〔16〕；用不同濃度的紫草素作用于子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞，48 h后檢測(cè)Bax和Bcl-2的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)隨著紫草素濃度的增加Bax和Bcl-2的表達(dá)量也上升，紫草素通過(guò)上調(diào)Bax的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡〔17〕；地榆類(lèi)化合物作用于胃癌細(xì)胞，可調(diào)節(jié)細(xì)胞中Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)，激活Caspase-3通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔18〕。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了地榆可以通過(guò)調(diào)控Caspase和Bax的表達(dá)影響子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡。

在許多腫瘤細(xì)胞上清中可檢測(cè)到炎癥因子含量比正常細(xì)胞中高，研究認(rèn)為，過(guò)量表達(dá)的炎癥因子往往與腫瘤疾病的發(fā)生密切相關(guān)〔19，20〕。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與微環(huán)境中存在的炎癥因子有關(guān)，各種炎癥介質(zhì)有利于腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，通過(guò)炎癥信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡〔21〕。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，子宮內(nèi)膜癌的危險(xiǎn)因素之一是炎癥因子的產(chǎn)生，炎癥因子在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中分泌增多，檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌中細(xì)胞IL-6蛋白表達(dá)上調(diào)，IL-6可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)-核因子(NF)-κB信號(hào)通路促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖〔22〕。TNF-α可促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的浸潤(rùn)生長(zhǎng)，還可促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌上皮細(xì)胞的增殖〔23〕。因此，通過(guò)抑制和干擾炎癥因子的產(chǎn)生可為子宮內(nèi)膜癌的治療提供新的方向。本研究提示地榆可以減少子宮內(nèi)膜癌炎癥因子表達(dá)。

地榆促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡，抑制炎癥因子的分泌，在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮作用。炎癥因子可能通過(guò)特定的信號(hào)通路促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展，因此，通過(guò)地榆抑制炎癥形成過(guò)程中的炎癥因子可為子宮內(nèi)膜癌的治療提供新的方向。