紫杉醇聚酰胺聚合物膠束制備及表征

王彥會 王瑩 趙文萃 張琦 趙慶蘭

(1吉林省肝膽病醫(yī)院，吉林 長春 130021；2解放軍九六四醫(yī)院；3江西中醫(yī)藥大學(xué))

紫杉醇(PTX)從短葉紅豆杉的樹皮中分離得到而命名，其作用機(jī)制是具有獨特的抗微管作用，促進(jìn)微管蛋白聚合及抑制微管的解聚，阻礙細(xì)胞內(nèi)骨架合成，從而干擾有絲分裂〔1～5〕。它主要用于治療乳腺癌、卵巢癌及非小細(xì)胞肺癌等〔6～8〕。PTX是一種疏水性藥物〔9〕，因此，提高溶解性是PTX制劑的首要問題。目前，國內(nèi)外市售PTX制劑中除注射用PTX脂質(zhì)體(力樸素)為脂質(zhì)體載體外，均為聚氧乙烯蓖麻油與乙醇作為溶媒制劑，其中聚氧乙烯蓖麻油具有腎毒性、變態(tài)反應(yīng)和神經(jīng)毒性等不良反應(yīng)，應(yīng)用受到很大影響。另外，PTX作為細(xì)胞毒性的抗腫瘤藥物，因為缺乏腫瘤靶向性，甚至導(dǎo)致全身性毒性〔10〕，特別是中性粒細(xì)胞減少癥等免疫性疾病，這使得其臨床應(yīng)用受到很大限制。

本研究擬通過N-羥基琥珀酰亞胺-聚乙二醇(PEG)-馬來酰亞胺的羥基琥珀酰亞胺活化酯與聚酰胺聚合物(PAMAM)表面的伯氨基反應(yīng)生成穩(wěn)定的酰胺鍵實現(xiàn)PEG化，通過巰基與馬來酰胺基團(tuán)的特異性反應(yīng)將透明質(zhì)酸(HA)耦聯(lián)到PEG的另一端。最后將PTX通過順式烏頭酸酐耦聯(lián)到PAMAM表面尚未反應(yīng)的伯氨基上，進(jìn)行載藥，通過以上設(shè)計得到葉酸(FA)/HA雙靶向PAMAM載藥系統(tǒng)，并對其體外性能進(jìn)行評價。

1 材料與方法

1.1試劑和儀器 十八胺、N，N-二甲基甲酰胺、甲酰胺、N，N-二環(huán)己基碳二亞胺、FA、HA、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺均購自麥克林；硼酸購自天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；十水合四硼酸鈉、二甲基亞砜均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；NH2-PEG2000-COOH、透析袋均購自北京索萊寶科技有限公司；PAMAM購自威海晨源分子新材料有限公司；PTX購自大連美侖生物技術(shù)有限公司。儀器為H-J磁力加熱攪拌器(鞏義市裕華儀器有限責(zé)任公司)，PH400基礎(chǔ)型酸度計(安萊利斯有限公司)，TY96-11IV超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新藝生物科技葛粉有限公司)，高速冷凍離心機(jī)(Thermo)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅有限公司)，GOLD-SIM冷凍干燥機(jī)(美國金西盟國際集團(tuán))，透射電鏡(TEM)(日立)，動態(tài)光散射(DLS)(美國布魯克海文儀器公司)。

1.2PAMAM熒光標(biāo)記物的制備 利用PAMAM的氨基末端與異硫氰酸熒光素的異硫氰基可以共價結(jié)合的化學(xué)反應(yīng)，制備熒光標(biāo)記物。稱取適量PAMAM，溶于磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)中，緩慢滴加異硫氰酸熒光素的丙酮溶液。摩爾比為PAMAM∶異硫氰酸熒光素=1∶1.2。避光磁力攪拌36 h，透析袋中透析3 d，離心除去未反應(yīng)的異硫氰酸熒光素，凍干得到異硫氰酸熒光素標(biāo)記的PAMAM聚合物。異硫氰酸熒光素在488 nm激發(fā)波長下，顯示特征綠色熒光。

1.3PAMAM-PEG的合成 稱取硼砂1.895 3 g、硼酸 1.235 7 g 溶于1 L蒸餾水中，得到pH8.0的緩沖溶液，避光保存。將PAMAM 2.079 6 g和PEG 0.141 0 g溶于20 ml硼砂-硼酸緩沖液中，室溫，避光，磁力攪拌12 h(轉(zhuǎn)速為1 000 r/min)。將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至50 kD截留分子量的超濾管中超濾，轉(zhuǎn)速為4 000 r/min，30 min/次，共超濾7次，收集上層液體，放入-20℃冰箱冷凍保存，后放入冷凍干燥機(jī)中凍干，凍干后稱重、密封保存，備用。

1.4HA-C18的合成 稱取HA 100 mg，溶于甲酰胺20 ml，50℃水浴加熱，磁力攪拌(轉(zhuǎn)速為1 000 r/min)直至完全溶解，冷卻至室溫。加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽480 mg，N-羥基琥珀酰亞胺290 mg，冰浴磁力攪拌(轉(zhuǎn)速為1 000 r/min)2 h，充分反應(yīng)，得到混合物1。稱取十八烷胺30 mg，溶于15 ml無水二甲基甲酰胺中，充分溶解后，緩慢滴加至上述混合物1中，兩者混合液在60℃氮氣環(huán)境下攪拌5 h，然后在氮氣環(huán)境下室溫攪拌24 h。將上述反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至透析袋中(截留分子量7 000 D)在水/乙醇(V/V，等容積比)1 000 ml中透析24 h，然后將透析過的上述混合液在蒸餾水中透析24 h。所得混合物離心除去不溶雜質(zhì)，將所得液體放入-20℃冰箱冷凍保存，然后放入冷凍干燥機(jī)中凍干后稱重、密封保存，備用。

1.5FA-HA-C18的合成 稱取FA 102.3 mg，溶于30 ml二甲基亞砜中，使其充分溶解。稱取二環(huán)己基碳二亞胺92 mg，N-羥基琥珀酰亞胺33 mg，加入上述液體中，室溫避光活化反應(yīng)5 h。將上述HA-C18用15 ml無水甲酰胺溶解，將FA-N-羥基琥珀酰亞胺-二環(huán)己基碳二亞胺濾液緩慢滴入上述含HA-C18的無水甲酰胺溶液中，避光，磁力攪拌(轉(zhuǎn)速為1 000 r/min)48 h。將反應(yīng)后的FA-HA-C18反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至透析袋中(截留分子量7 000 D)在NAHCO3-NA2CO3緩沖液(NAHCO33.34 g和NA2CO31 g定容至1 L雙蒸水中)中透析24 h。將透析過的上述混合液，在蒸餾水中透析24 h。所得混合物離心除去不溶雜質(zhì)，將所得液體放入-20℃冰箱冷凍保存，放入冷凍干燥機(jī)中凍干后稱重、密封保存，備用。

1.6PTX-PAMAM-PEG-FA-HA-C18膠束的制備 稱取PTX 50 mg，溶于2.5 ml無水乙醇中，用無水乙醇溶解的PTX緩慢滴加至FA-HA-C18的溶液中(FA-HA-C18凍干粉40 mg，以2.5 mg/ml濃度溶解于蒸餾水中)，磁力攪拌24 h，冰浴超聲10 min(超聲功率200 W，工作2 s，間歇3 s)，溶液于4 000 r/min離心30 min，上清液經(jīng)過0.45 μm濾膜，得到FA-HA-PTX混合物。在上述混合液中加入N-羥基琥珀酰亞胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，室溫避光反應(yīng)12 h，加至PEG-PAMAM的水溶液中。用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至8.0，室溫避光反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后，用蒸餾水透析，離心除雜質(zhì)，將所得液體放入-20℃冰箱冷凍保存，放入冷凍干燥機(jī)中凍干后稱重、密封保存，備用。

1.7載PTX膠束中藥物含量測定 稱取3 mg載PTX膠束，加入3 ml乙腈，探頭超聲15 min(2 s，2 s)使得載體結(jié)構(gòu)被充分破壞，過0.45 μm微孔濾膜，續(xù)濾液作為供試品溶液，用高效液相檢測PTX的含量。按公式計算載藥量及包封率。制劑的載藥量(%)=制劑中所含藥物重量/制劑總重量×100%；制劑的包封率(%)=制劑中所含藥物重量/投藥量×100%。

1.8載PTX膠束的表征 通過透射電子顯微鏡(TEM)觀察膠束的形態(tài)和分散度。通過動態(tài)光散射(DLS)〔垂直偏振He-Ne激光，十八角度激光散射儀(DAWN EOS)，散射角定為90°，檢測溫度為25℃〕觀察膠束的粒徑。

1.9載PTX膠束的穩(wěn)定性考察 稱取3 mg載PTX膠束，加入3 ml乙腈，探頭超聲15 min(2 s，2 s)使得膠束的結(jié)構(gòu)被充分破壞，過0.45 μm微孔濾膜，續(xù)濾液作為供試品溶液制備供試品，分別于0，1，2，4，6，8，12 h進(jìn)樣，利用高效液相檢測PTX濃度，記錄其峰面積。

1.10載PTX膠束的體外釋放行為考察 采用透析袋擴(kuò)散技術(shù)來測定載藥制劑的體外釋放情況，以pH7.4 PBS + 0.1% 十二烷基硫酸鈉作為釋放介質(zhì)，選用截留分子量為10 000的透析袋，使得釋放出的游離PTX可以透過透析袋進(jìn)入到PBS中，通過測定釋放介質(zhì)中的PTX含量來初步評價釋藥情況。稱取載藥制劑3 mg，加入5 ml透析介質(zhì)(pH7.4 PBS + 0.1% 十二烷基硫酸鈉)溶解后，轉(zhuǎn)移至透析袋(截留分子量為10 000)中，透析袋兩端扎緊，浸入20 ml透析介質(zhì)中，于(37±1)℃下，100 r/min振蕩。分別在0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0、36.0、48.0、72.0、96.0 h吸取透析液1 ml，同時補充1 ml同溫度的透析介質(zhì)。利用高效液相法檢測并計算PTX含量，再按公式計算累積釋放百分率。累積釋放百分率(%)=CV×100%/制劑中所含PTX量；C：時間點的樣品濃度，mg/ml；V：時間點的釋放介質(zhì)體積。

2 結(jié) 果

2.1PTX-PAMAM聚合物的表征 用磁共振氫譜(1H-NMR譜)對合成所得產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，PTX、PAMAM-PEG、FA-HA-C18的特征峰說明成功地將三組分引入到PTX-PAMAM-PEG-FA-HA-C18結(jié)構(gòu)中。見圖1。

圖1 產(chǎn)物的1H-NMR譜

2.2載PTX膠束的生化表征 膠束的PTX載藥量為18.50%，包封率為50.13%。圖2可見，膠束為結(jié)構(gòu)規(guī)整、分散性好、粒徑較均一的球形膠束。另外，從DLS測定結(jié)果中，還可得出膠束的平均粒徑約為329 nm。

圖2 載PTX膠束的TEM

2.3載PTX膠束的穩(wěn)定性 將膠束加入乙腈中，探頭超聲使得膠束結(jié)構(gòu)被充分破壞，過微孔濾膜，分別于0，1，2，4，6，8，12 h收集續(xù)濾液，記錄其峰面積分別為3 672 301.750、3 532 999.750、3 618 709.750、3 560 782.875、3 568 750.025、3 626 341.438、3 545 328.250 μV·s，平均3 589 316.263 μV·s，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.41%。在12 h內(nèi)峰面積穩(wěn)定，表明膠束穩(wěn)定性較好。

2.4載PTX膠束的體外釋放 前6.0 h之內(nèi)，PTX從膠束中釋放較快，載藥制劑累積釋放百分率為0.5 h 2.07%、1.0 h 8.43%、2.0 h 18.60%、4.0 h 25.02%、6.0 h 49.13%，8.0～96.0 h內(nèi)釋放緩慢，8.0 h 69.81%、12.0 h 78.45%、24.0 h 88.14%、36.0 h 94.02%、48.0 h 96.71%、72.0 h 96.85%、96.0 h 97.01%。充分體現(xiàn)了高分子聚合物膠束的緩釋效應(yīng)。

3 討 論

分子物質(zhì)和脂質(zhì)在腫瘤組織透過性增強(qiáng)及滯留效應(yīng)稱作實體瘤的高通透性和滯留效應(yīng)(EPR)〔11～13〕，EPR促進(jìn)了大分子類物質(zhì)在腫瘤組織的選擇性分布，可以增加藥效并減少系統(tǒng)副作用，本研究基于EPR原理，將高分子聚合物與小分子化療藥物的耦聯(lián)物，通過藥劑學(xué)手段結(jié)合到高分子材料表面。PAMAM是一類目前得到廣泛應(yīng)用的樹枝狀聚合物材料〔14〕，其本身能物理包埋或化學(xué)結(jié)合小分子藥物，其表面的官能團(tuán)還能連接多種對機(jī)體某些器官、組織和細(xì)胞有特異性相互作用的靶向配基，從而將包封或者耦聯(lián)的藥物帶到病變部位實現(xiàn)主動靶向治療。PEG具有優(yōu)良的親水性〔15〕，且無毒，無免疫原性。PEG化是藥物制劑中常用的手段〔16，17〕，對于PAMAM聚合物，PEG化不僅可降低載藥系統(tǒng)的毒性，而且可進(jìn)一步提高載藥系統(tǒng)的分子量和親水性〔18〕，從而減少網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的攝取，延長血液中的滯留時間，增強(qiáng)EPR，實現(xiàn)對腫瘤的被動靶向作用。本研究成功地將PTX、PAMAM-PEG、FA-HA-C18三組分引入到PTX-PAMAM-PEG-FA-HA-C18結(jié)構(gòu)中；并獲得高載藥量、高包封率、結(jié)構(gòu)規(guī)整、分散性好、粒徑均一、穩(wěn)定性較好的膠束，有效地緩解了傳統(tǒng)納米粒的突釋效應(yīng)，具有獨特的優(yōu)勢。本研究采用了對PAMAM進(jìn)行PEG化的思路，也為主動雙靶向修飾提供了可行的途徑，這種方法是很有前景的，值得深入研究。