Mortalin蛋白過表達在胃腺癌預后評估中的意義

張源 孫潔 陳麗艷 林貞花, 任香善, 秦云植

(延邊大學 1醫(yī)學院病理學教研室，吉林 延吉 133002；2腫瘤研究中心；3吉林省科技廳重點實驗室；4延邊大學附屬醫(yī)院麻醉科)

目前，針對胃癌的治療策略包括手術治療、化療等，但預后并不理想，腫瘤轉移和復發(fā)仍是導致胃癌患者死亡的主要原因〔1～4〕。到目前為止，胃癌的發(fā)病機制尚未完全闡明，因此，從分子水平尋找和發(fā)現(xiàn)能夠識別和預測GAC的有效檢測指標及分子治療的靶點極其重要。

Mortalin蛋白又稱為葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP)75，屬于分子伴侶熱休克蛋白(HSP)70家族成員之一〔5,6〕。近年來的研究顯示,Mortalin蛋白參與細胞周期調(diào)控、代謝、信號轉導等多種生物學過程,與一些腫瘤的發(fā)展和轉移關系密切，如乳腺癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌等〔7～10〕，但尚未見其異常表達與胃腺癌(GAC)及其預后之間關系的研究。本文擬分析Mortalin蛋白表達水平與GAC特征和預后之間的相關性。

1 材料與方法

1.1材料 臨床資料齊全的組織標本選自延邊大學腫瘤研究中心組織庫。包括157例GAC組織、29例胃上皮內(nèi)瘤變和46例正常胃黏膜組織。在GAC患者中，男102例，女55例；年齡≥60歲65例，<60歲92例；腫瘤位置：賁門/胃底68例，胃體/胃竇67例，全胃22例；國際TNM分期標準：Ⅰ～Ⅱ期83例，Ⅲ～Ⅳ期74例；分化程度：未/低分化90例，中/高分化67例；有淋巴轉移81例，無淋巴轉移者76例；浸潤深度：T1～2的有52例，T3～4的有105例。人胃癌BGC-823細胞系由韓國延世大學張香蘭研究員提供。

1.2材料 免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋公司；免疫熒光二抗lexa Fluor 568山羊抗鼠IgG 購自Invitrogen 公司； Mortalin 鼠抗人單克隆抗體購自Sigma公司； RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自 Gibco 公司、胰蛋白酶購自 Santa Cruz 公司。

1.3主要方法

1.3.1免疫熒光染色 在加入了10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中接種人胃癌BGC-823細胞，將其放置在37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。選取對數(shù)生長期細胞，依次進行：磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，每次5 min；加入4%多聚甲醛固定30 min；PBS漂洗3次，每次5 min；用0.5% Triton X-100滲透30 min；PBS漂洗3次，每次5 min；5%牛血清白蛋白溶液(BSA)室溫封閉1 h；Mortalin抗體(1∶1 000)孵育，于4℃冰箱中孵育過夜；次日依次進行：PBS漂洗3次，每次5 min；免疫熒光二抗(1∶400)孵育1 h；PBS漂洗3次，每次5 min；使用4',6-二脒基-α-苯基吲哚(DAPI)封片、固定并在顯微鏡下觀察。

1.3.2免疫組化染色 染色步驟：常規(guī)脫蠟、抗原修復，加入一抗(1∶200稀釋)4℃孵育過夜；次日滴加二抗，孵育45 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染，中性樹膠封固。為證明Mortalin蛋白抗體免疫組化檢測的特異性，實驗中應用鼠IgG代替一抗作為對照，結果為陰性。同時，選擇Mortalin蛋白陽性染色的切片，以PBS代替一抗染色的結果為陰性，以此作為結果可信的實驗依據(jù)。

1.3.3結果判定 根據(jù)Beesley等〔11〕分級法，Mortalin蛋白表達以在細胞質中出現(xiàn)棕褐色顆粒的比例作為判定陽性染色標準。結合染色強度，根據(jù)陽性細胞數(shù)的比例將染色結果分為4級：陽性細胞數(shù)0%～5%為0級(-)；6%～25%為1級(+)；26%～50%為2級()；≥51%為3級()。同時，計算陽性率的方法設定為兩種：(1)陽性率：≥1級的陽性染色病例占總病例數(shù)的百分數(shù)；(2)強陽性率：2～3級陽性染色病例占總病例數(shù)的百分數(shù)。

1.4統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0軟件行χ2檢驗。

2 結 果

2.1Mortalin蛋白在GAC細胞和組織中過表達 免疫熒光染色結果顯示，Mortalin主要定位于胃癌BGC-823細胞的細胞質中，見圖1。通過檢索Oncomine數(shù)據(jù)庫和TCGA數(shù)據(jù)庫(www.oncomine.org/resource/login.html；www.tcga.org)中的樣本數(shù)據(jù)，Mortalin蛋白在GAC組織中表達高于正常胃組織(P均<0.05)，見圖2。

圖1 免疫熒光染色結果(×200)

圖2 Mortalin在Oncomine數(shù)據(jù)庫和TCGA數(shù)據(jù)庫樣本中的表達(www.oncomine.org/resource/login.html；www.tcga.org)

Mortalin蛋白在正常胃黏膜組織中的陽性率和強陽性率分別為2.2%(1/46)和0%(0/46)，在胃上皮內(nèi)瘤變組織中的陽性率和強陽性率分別為65.5%(19/29，-10例，+13例，3例，3例)和20.7%(6/29)，在GAC組織中的陽性率和強陽性率分別為87.9%(138/157，-19例，+25例，42例，71例)和72.0%(113/157)，差異均有顯著性(P均<0.05)，見圖3。

2.2Mortalin表達水平與GAC患者臨床病理學特征的關系 Mortalin蛋白過表達與GAC分化程度、浸潤深度及淋巴結轉移密切相關(P均<0.05)。Mortalin蛋白在未/低分化和中/高分化GAC組織中的強陽性率分別為78.9%(71/90)、62.7%(42/67)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；在浸潤深度為T3～4的GAC組織中Mortalin蛋白強陽性率為78.1%(82/105)，明顯高于浸潤深度為T1～2的GAC組織的59.6%(31/52)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；在淋巴結轉移的GAC組織中強陽性率高達80.2%(65/81)，顯著高于無淋巴結轉移組(63.2%，48/76)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4，5。

正常胃黏膜組織中Mortalin蛋白呈陰性(A：×200，A1：×400)；胃上皮內(nèi)瘤變組織中Mortalin蛋白呈弱陽性(B：×200，B1：×400)：GAC組織中Mortalin蛋白呈強陽性(C：×200，C1：×400)圖3 免疫組化染色檢測Mortalin的表達

圖4 Mortalin蛋白表達水平與GAC分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移的關系

在中/高分化GAC中，Mortalin蛋白呈弱陽性(A：×200，A1：×400)；在未/低分化GAC中，Mortalin蛋白呈強陽性(B：×200，B1：×400)；在T1～2期的GAC中，Mortalin蛋白呈弱陽性(C：×200，C1：×400)；在T3～4期的GAC中，Mortalin蛋白呈強陽性(D：×200，D1：×400)；在無轉移的GAC中，Mortalin蛋白呈弱陽性(E：×200，E1：×400)；在有轉移的GAC中，Mortalin蛋白呈強陽性(F：×200，F(xiàn)1：×400)圖5 免疫組化染色檢測Mortalin蛋白在不同臨床病理特征GAC中的表達

2.3Mortalin表達水平與GAC患者生存期的關系 Mortalin蛋白高表達的GAC患者生存期較短，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖6。提示Mortalin蛋白過表達與GAC患者不良預后有關。

圖6 TCGA數(shù)據(jù)庫(www.tcga.org)中GAC患者的生存期分析

3 討 論

胃癌是全球范圍內(nèi)高發(fā)的惡性腫瘤。雖然胃癌的手術治療和靶向藥物研發(fā)等取得了明顯進展，但由于早期發(fā)現(xiàn)困難，導致許多胃癌中晚期患者即使經(jīng)過合理治療仍預后較差〔12〕。胃癌的發(fā)生、發(fā)展及侵襲和轉移是一系列復雜的生物進程，涉及多種基因、分子及其產(chǎn)物。

Mortalin蛋白所在的HSP家族由于具有可以和多種蛋白質分子結合的分子伴侶活性，近年來受到較多的關注和研究〔13〕。有報道發(fā)現(xiàn)Mortalin蛋白在人體多個組織和多種腫瘤中均有較高水平的表達，并且表現(xiàn)出不同的亞細胞定位：在正常細胞中定位于線粒體，而在腫瘤細胞中定位于細胞質〔14〕。Mortalin蛋白具有多種與癌細胞增殖相關的功能，包括線粒體生物合成、三磷酸腺苷(ATP)生成、抗凋亡等〔15～17〕,提示其有可能與腫瘤的不良預后有關。

本實驗結果發(fā)現(xiàn)，Mortalin主要定位于BGC-823細胞的細胞質中；與Cui等〔18〕在胰腺癌中、Chen等〔19〕在肝癌中、Jin等〔20〕在乳腺癌中的結果一致，推測Mortalin的高表達與腫瘤細胞的轉移、侵襲密切相關。同時，隨著GAC惡性程度的增加，Mortalin蛋白的表達亦顯著增強。Kaplan－Meier－Plotter數(shù)據(jù)庫(包含GEO數(shù)據(jù)集GSE62254)分析也顯示Mortalin 高表達的GAC患者5年總生存期較短。由此可推測Mortalin蛋白過表達與GAC患者的不良預后有關。

綜上所述，Mortalin蛋白參與GAC的演進過程，在GAC的轉移和侵襲中起著十分重要的作用，對于判斷GAC進展及預后具有重要指示意義，Mortalin蛋白高表達有望成為GAC預后不良的有效檢測指標及分子治療靶點。