敲除TMS5基因獲得溫敏不育粳稻新材料

杜茜 費云燕 王芳權(quán) 許揚(yáng) 王軍 李文奇 趙凌 陳智慧 梁國華 周勇 楊杰, *

敲除基因獲得溫敏不育粳稻新材料

杜茜1, 2, #費云燕1, 2, #王芳權(quán)1, 2許揚(yáng)1, 2王軍1, 2李文奇1, 2趙凌1, 2陳智慧1, 2梁國華1, 2周勇1, 2楊杰1, 2, *

(1揚(yáng)州大學(xué) 江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇 揚(yáng)州 225009;2江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所 / 國家水稻改良中心南京分中心/ 江蘇省優(yōu)質(zhì)水稻工程技術(shù)研究中心, 南京 210014;#共同第一作者;*通訊聯(lián)系人, E-mail: yangjie168@aliyun.com)

【】水稻溫敏不育系的選育是兩系雜交稻育種工作中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。是控制溫敏不育的重要基因，在生產(chǎn)上也應(yīng)用較廣。為了加快水稻溫敏不育系的選育進(jìn)程，利用CRISPR/Cas9技術(shù)，在武運粳7號背景下對基因進(jìn)行編輯。通過測序從22株T0代中篩選獲得6株純合的突變體，分析發(fā)現(xiàn)6個純合的突變體產(chǎn)生了相同的遺傳變異，都在基因第2外顯子44 bp和45 bp之間插入堿基“A”，導(dǎo)致翻譯提前終止。通過細(xì)胞學(xué)觀察和人工輔助授粉證實獲得的株系花粉敗育而雌配子正常發(fā)育。這些結(jié)果表明對溫敏不育基因基因進(jìn)行編輯可以快速獲得粳型溫敏雄性不育系。

粳稻；CRISPR/Cas9；溫敏雄性不育系

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，大約一半以上的人口以大米為主食[1]。利用雜種優(yōu)勢培育雜交稻是實現(xiàn)高產(chǎn)的重要途徑，而選育兩系不育系配制雜交組合是目前最有效最便捷的方法之一。兩系雜交水稻已成為我國推廣的主流雜交稻[2-3]。因此，加快兩系不育系的選育進(jìn)程具有重要的生產(chǎn)實踐意義。

CRISPR/Cas9定點編輯技術(shù)以DNA雙鏈為靶標(biāo)，在動植物中的運用越來越廣泛，它可以實現(xiàn)對基因組的精確編輯。2012年，Jinek等[4]在體外證明了Cas9核酸酶結(jié)合gRNA即可切割雙鏈DNA，為CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用奠定了堅實的基礎(chǔ)。2013年，Cong等[5]和Mali等[6]分別實現(xiàn)了在人類細(xì)胞中的基因編輯，掀起了基因編輯的高潮。近年來，基因編輯在改良水稻性狀與水稻分子育種等方面發(fā)揮了巨大的作用。2017年，Shen等[7]利用CRISPR/Cas9多基因編輯技術(shù)同時敲除水稻中8個基因(3個穗型基因、2個粒型基因、一個株型基因、一個香味基因和一個生育期基因)，獲得了不同的突變體組合。2018年，汪秉坤等[8]對()基因進(jìn)行敲除，成功培育出低直鏈淀粉含量的糯稻新品種。這些研究表明基因組編輯是水稻快速定向遺傳改良的重要手段。

目前，與水稻光溫敏不育相關(guān)的主效基因已經(jīng)在不同的染色體中定位[9-17]，并且在不同的染色體上也檢測到不同的QTL位點[18-19]?；蚴强刂扑緶孛舨挥闹餍Щ蛑?，它能夠通過編碼RNase ZS1降解花粉母細(xì)胞中表達(dá)的UbL40mRNA。野生型水稻中，高溫誘導(dǎo)UbL40mRNA積累，RNase ZS1可以通過降解UbL40mRNA維持花粉育性；溫敏不育系中，基因編碼區(qū)第1外顯子中第71位堿基均發(fā)生由C到A的點突變，形成終止密碼子，導(dǎo)致翻譯提前終止，RNase ZS1功能缺失，UbL40mRNA積聚，導(dǎo)致水稻花粉不育，我國主要的25個光溫敏不育系中有24個含有基因[20-21]。截至2018年，我國通過國家審定的兩系法雜交水稻品種130個，通過省級審定的兩系雜交水稻1431個(http://www.ricedata.cn/variety/)。因此，在我國兩系育種的應(yīng)用中有著極其重要的地位。

近幾年來，編輯基因獲得了系列溫敏雄性不育新資源。Zhou等[22]以中花11為背景，運用CRISPR/Cas9技術(shù)對不同類型的粳稻、秈稻和三系保持系的基因的10個靶位點進(jìn)行基因編輯，獲得了不同突變類型的溫敏不育突變體材料，并在一年內(nèi)獲得無外源基因成分的溫敏不育株系。黃忠明等[23]培育出粳稻突變體。同年，吳明基[24]等利用CRISPR/Cas9技術(shù)轉(zhuǎn)化優(yōu)良中間材料GH89獲得不育系材料。Barman等[25]對秈稻品種中嘉早17的基因進(jìn)行敲除，獲得了具有產(chǎn)量潛力的秈型溫敏核雄性不育系YK17S。Li等[26]編輯了具有華占血緣的中間材料Pinzhan的、和基因，并成功獲得了抗病性增強(qiáng)的溫敏雄性不育材料PinzhanS。

武運粳7號是由江蘇省武進(jìn)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所選育的早熟晚粳常規(guī)稻品種，并且在2000年通過國家農(nóng)作物品種審定委員會審定。該品種綜合品質(zhì)優(yōu)良，適合長江中下游地區(qū)種植，僅用5年時間種植面積突破66.7 hm2，創(chuàng)造同類品種之最。2000年，王小虎等[27]以BT型矮A為母本，與武運粳7號雜交并連續(xù)回交6代后育成三系不育系新品種“武運粳7號A”。利用該不育系配制的三系雜交種雜種優(yōu)勢強(qiáng)，但由于制種產(chǎn)量低，未能在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。為探索武運粳7號兩系法雜種優(yōu)勢利用途徑，我們運用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除武運粳7號中的基因，以期獲得粳型溫敏不育新種質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

轉(zhuǎn)化背景材料為早熟晚粳品種武運粳7號，種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院人工氣候箱(PRX-1000D)。所用引物(表1)的合成及測序由南京擎科生物技術(shù)有限公司完成，I、T4DNA連接酶和KOD FX分別購自NEB、TaKaRa和TOYOBO公司，其他試劑購自天根生化科技有限公司。

1.2 基因編輯靶點設(shè)計

通過CRISPR-P網(wǎng)站(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi- bin/CRISPR)對進(jìn)行靶點分析。在第2外顯子上挑選了一段特異性較高的20 bp堿基序列-1作為CRISPR的靶點。由于PAM序列TGG上游第20位堿基處與U3啟動子的轉(zhuǎn)錄起始點一樣都是A，因此優(yōu)先使用U3啟動子。

1.3 載體構(gòu)建

根據(jù)劉耀光實驗室的方法[28]，在靶點序列正義鏈和反義鏈的5′端分別添加Ⅰ酶切位點GGCA和AAAC，使其與pUC18骨架經(jīng)2個Ⅰ切割后形成黏性末端。將靶點接頭引物-U3-F/-U3-R混合均勻(終濃度1 μmol/L)，95℃下變性3 min后退火形成二聚體。配制10 μLⅠ-連接反應(yīng)液(1 μL引物二聚體，1 μL pYL-U3-gRNA載體，0.5 μLⅠ，1 μL T4DNA連接酶緩沖液，0.2 μL T4DNA連接酶和6.3 μL ddH2O)，通過邊切邊連的方法將接頭連接到pYL-U3-gRNA上。通過兩輪巢式PCR，擴(kuò)增含有-1的gDNA表達(dá)盒U3--1-gRNA(第一輪PCR擴(kuò)增使用通用引物U-F/U-R，第二輪PCR擴(kuò)增使用特異性引物Uctcg-B1′/gRcggt-BL)。最后，將擴(kuò)增出的靶標(biāo)gDNA盒通過Ⅰ和T4DNA連接酶組裝到pYLCRISPR/Cas9-MH載體上(酶切連接同時進(jìn)行)，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。引物SP1/SP2用于檢測生長出的克隆中是否含有sgRNA表達(dá)盒連接片段。挑選含有目的條帶的克隆進(jìn)行測序分析。具體引物序列見表1。所有引物均由南京擎科生物技術(shù)有限公司合成。

表1 本研究所用的引物

1.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻遺傳轉(zhuǎn)化

測序正確的pYLCRISPR/Cas9-MH-- gRNA通過熱擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105()。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)侵染水稻愈傷組織的方法，將鑒定正確的克隆轉(zhuǎn)化水稻品種武運粳7號。具體步驟參考Hiei等[29]的方法。

1.5 T0代植株突變位點分析

采用CTAB法提取T0轉(zhuǎn)基因植株的葉片基因組DNA，并使用引物TMS5-TF和TMS5-TR(表1)對靶序列附近的片段進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增片段送公司進(jìn)行測序分析。通過比較轉(zhuǎn)基因植物和野生型品種武運粳7號的序列差異來確定轉(zhuǎn)基因植株的氨基酸變化和突變類型。

1.6 T1代植株T-DNA檢測

不同變異類型的T0代轉(zhuǎn)基因植株自交結(jié)實后獲得的T1代種子種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院溫室大棚。幼苗提取T1代轉(zhuǎn)基因植株的葉片基因組DNA，并用潮霉素特異引物Hpt-F/Hpt-R和Cas9基因特異引物Cas9-F/Cas9-R(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。兩者均擴(kuò)增不出目的條帶的植株即為無T-DNA的T1代轉(zhuǎn)基因植株。

1.7 碘-碘化鉀染色檢測花粉育性

隨機(jī)選取當(dāng)日開花前野生型和突變體的穎花，于卡諾固定液(乙醇∶冰醋酸=3∶1)中固定，4℃下保存。鏡檢時滴加1% I2-KI染液于載玻片上，用鑷子夾取一枚穎花并小心夾碎花藥，去掉殘余花藥壁，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察并拍照。通過觀察花粉粒染色情況和細(xì)胞形態(tài)來判斷花粉粒的育性?？捎ǚ哿３屎谏?、圓形，敗育花粉粒則染色不完全或不上色，并且形狀為不規(guī)則或者圓形。

2 結(jié)果與分析

2.1 TMS5靶位點設(shè)計和pYLCRISPR/Cas9- TMS5-gRNA表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)基因的編碼區(qū)序列，結(jié)合CRISPR-P網(wǎng)站(http://cbi.hzau.edu.cn/ cgi-bin/ CRISPR)進(jìn)行靶位點序列分析。經(jīng)過篩選，在基因第2外顯子區(qū)域選擇了一個特異性較好的20 bp堿基序列作為基因靶位點序列(圖1-A)。使用Ⅰ和T4DNA連接酶邊切邊連的方法將-1連接到pYL-U3-gRNA上，通過兩輪巢式PCR擴(kuò)增得到的啟動子gRNA表達(dá)盒(U3-gRNA)組裝到pYLCRISPR/Cas9-MH載體上(圖1-B)。組裝好的表達(dá)載體-1-gRNA表達(dá)盒由OsU3啟動子驅(qū)動，Cas9由Ubi啟動子驅(qū)動。構(gòu)建成功的CRISPR/Cas9表達(dá)載體通過熱擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105。最后，通過根癌農(nóng)桿菌侵染水稻愈傷組織的方法轉(zhuǎn)化水稻粳稻品種武運粳7號。

A?靶序列在TMS5基因中的位置；紅色方框代表PAM結(jié)構(gòu)；B? pYLCRISPR/Cas9-TMS5-1表達(dá)載體。

Fig. 1. Schematic diagram of the targeted sequence inand pYLCRISPR/Cas9--1 vector.

表2 T0代轉(zhuǎn)基因植株中的突變率統(tǒng)計

*為終止密碼子。

Fig. 2. Amino acid sequence variance between wild type(WT) andmutant.

2.2 T0代轉(zhuǎn)基因植株突變類型分析

2018年共獲得22株T0代轉(zhuǎn)基因植株。利用靶位點序列附近的檢測引物TMS5-TF和TMS5-TR擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA并進(jìn)行測序分析。測序結(jié)果分析表明，22株T0代轉(zhuǎn)基因植株中共有18株發(fā)生不同類型的突變，突變率為81.8%。其中大部分的突變類型為雙等位突變，約占40.9%；純合突變的共有6株占27.3%，均為單堿基的插入；雜合突變較少，僅為13.6%(表2)。

2.3 野生型與突變體氨基酸序列分析

基因位于第2染色體，cDNA全長1895 bp，包含6個外顯子和5個內(nèi)含子，編碼全長為303個氨基酸的蛋白(圖2)。通過測序分析發(fā)現(xiàn)，6個純合突變體植株都屬于同一突變類型，均在第2外顯子處插入一個堿基“A”，導(dǎo)致第175位氨基酸絡(luò)氨酸(TAT)變成終止密碼子TAA，翻譯提前終止。

2.4 T1代T-DNA剔除

提取了T1代植株苗期DNA，利用潮霉素和Cas9基因特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，T1代轉(zhuǎn)基因植株中共獲得了7株既沒有潮霉素抗性標(biāo)記基因也沒有Cas9標(biāo)記基因的植株(圖3)。

M?DNA標(biāo)記；+：陽性對照；-：日本晴。

Fig. 3. Screening for T-DNA-free plants of T1mutation lines by PCR analysis.

2.5 tms5突變體表型觀察

突變體和野生型武運粳7號的農(nóng)藝性狀調(diào)查結(jié)果表明，灌漿時期的野生型武運粳7號能夠正常灌漿結(jié)實，突變體卻不能正常結(jié)實(圖4)。因此，突變會導(dǎo)致不結(jié)實。

2.6 花粉育性觀察

為了解析基因突變后造成水稻不育的原因，我們分別在顯微鏡上觀察了野生型和突變體的花藥形態(tài)。在人工氣候箱平均溫度為28℃的條件下，野生型花藥飽滿并且呈明黃色，而突變體的花藥瘦弱泛白(圖5-A、B)。I2-KI花粉染色的觀察結(jié)果表明，育性正常的野生型武運粳7號花粉呈典型的飽滿圓粒，并且能夠被I2-KI染成深黑色，而突變體植株花粉顆粒呈現(xiàn)不規(guī)則形狀并且不能被染色，其中90%以上為碘敗，其余均為圓敗(圖5-C、D)。因此，花藥形態(tài)和花粉I2-KI染色的結(jié)果都表明在28℃條件下突變體的不育性是由花粉敗育引起的。以武運粳7號和秈稻9311的花粉授予突變體，突變體能夠灌漿結(jié)實 (圖6)，表明突變體的雌蕊發(fā)育正常。

圖4 野生型和突變體的表型

Fig. 4. Phenotype of wild type(WT) and themutant.

A?野生型花藥形態(tài)；B?tms5突變體花藥形態(tài)；C?野生型花粉染色；D?tms5突變體染色。

Fig. 5. Comparison of pollen fertility between wild type (WT) andmutant.

A?tms5突變體與9311雜交F1的結(jié)實情況；B?tms5突變體與武運粳7號雜交F1的結(jié)實情況。

Fig. 6. Seed setting of the F1plants derived from×9311 and×Wuyunjing 7.

3 討論

水稻光溫敏核雄性不育材料的發(fā)現(xiàn)和利用開辟了水稻雜種優(yōu)勢利用的新途徑。目前，常見的溫敏不育系大多由農(nóng)墾58S、安農(nóng)S-1或株1S轉(zhuǎn)育而來[30]，而國家水稻數(shù)據(jù)中心的數(shù)據(jù)表明我國應(yīng)用面積最廣的不育系幾乎都是秈型不育系。利用傳統(tǒng)的雜交轉(zhuǎn)育，將秈稻中的不育基因轉(zhuǎn)育到粳稻背景中，秈粳雜交后代難以穩(wěn)定，育種周期長，成為粳稻兩系雜種優(yōu)勢利用的主要限制因素之一。因此，探索利用基因組編輯技術(shù)創(chuàng)制粳型溫敏不育系對于加快兩系雜交粳稻育種具有重要意義。另外，相對于秈稻，粳稻遺傳轉(zhuǎn)化效率高，有利于快速培育粳稻溫敏不育系。

本研究選用曾在江蘇大面積推廣應(yīng)用的粳稻品種武運粳7號作為背景材料編輯基因。在22株T0植株中獲得突變體18株，突變頻率高達(dá)81.8%，其中6株為純合突變，純合突變率為27.3%，均為PAM序列上游第3堿基處的插入。表明對粳稻基因編輯的效率較高。突變株的自交結(jié)實率為0%，花粉染色為圓敗和碘敗，花藥相對于野生型瘦弱并泛白，利用人工輔助授粉，能獲得野生型武運粳7號和秈型品種9311雜交種，表明突變體花粉敗育而雌蕊發(fā)育正常，由此獲得了一個不育材料。這為快速獲得粳稻不育材料奠定了基礎(chǔ)。

由于材料條件的限制，我們尚未開展育性轉(zhuǎn)換的溫度研究。本研究中，突變體生長在28℃的環(huán)境中，表現(xiàn)為花粉完全敗育，推測起點溫度低于28℃。Zhou等[22]對不同水稻品種突變體的研究中發(fā)現(xiàn)，以粳稻品種GAZ為背景的不育株不育起點溫度約為26℃；以秈稻品種為背景的不育株ZZBS(中浙B背景)和YJSMS(粵晶絲苗背景)不育起點溫度低于24℃，ReBS(ReB背景)、TFBS(天豐B背景)和WSSMS(五山絲苗背景)不育起點溫度為24℃，ZS97BS(珍汕97B背景)不育起點溫度約為26℃。黃忠明等[23]在對以粳稻F197為背景的純合突變體不育起點溫度的研究中發(fā)現(xiàn)28℃是突變體花粉育性的轉(zhuǎn)換溫度。吳明基等[24]、Barman[25]、Li等[26]對秈型品種突變體花粉育性研究中發(fā)現(xiàn)花粉育性轉(zhuǎn)化溫度分別為24℃、22℃和23.5℃。這些結(jié)果表明不同遺傳背景的水稻材料育性起點溫度不同，并且粳稻材料背景的溫敏不育系育性起點溫度略高于秈稻背景材料的溫敏不育系。選育起點溫度低的不育系是兩系制種技術(shù)的關(guān)鍵，可以利用不同背景的粳稻品種資源編輯基因，篩選起點溫度更低的溫敏不育系，加快粳稻溫敏不育系選育進(jìn)程。

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Thermo-sensitive Male Sterile Line Created by EditingGene inRice

DU Xi1, 2, #, FEI Yunyan1, 2, #, WANG Fangquan1, 2, XU Yang1, 2, WANG Jun1, 2, LI Wenqi1, 2, ZHAO Ling1, 2, CHEN Zhihui1, 2, LIANG Guohua1, 2, ZHOU Yong1, 2, YANG Jie1, 2, *

( Jiangsu Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China; Institute of Food Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences / Nanjing Branch of Chinese National Center for Rice Improvement / Jiangsu High Quality Rice R & D Center, Nanjing 210014, China;These authors contributed equally to this work;Corresponding author, E-mail:)

【】The breeding of thermo-sensitive male sterile rice lines is a key step in the breeding of two-line hybrid rice.is the key gene that modulates pollen fertility of rice at different temperatures and has been widely used in rice breeding. In order toaccelerate the breeding process of thermo-sensitive sterility lines, 【】CRISPR/Cas9 technology was used to editwith arice variety Wuyunjing 7 as a material. 【】Sequencing analysis showed that six homozygous mutants screened from 22 strains of T0generation produced the same genetic variation, and one base “A” was inserted between 44 bp and 45 bp of the second exon ofof all the six mutants, resulting in pre-maturation of translation. Cytological observation and artificial pollination confirmed that the pollen ofmutant was aborted and the development of female gametes was normal.】These results indicated that the thermo-sensitive male sterile lines could be obtained rapidly by knocking out the thermo-sensitive male sterile geneinrice.

rice; CRISPR/Cas9; thermo-sensitive male sterile line

Q945.78; S511.034

A

1001-7216(2019)05-0429-07

10.16819/j.1001-7216.2019.9035

2019-03-28；

2019-04-23。

國家重點研發(fā)計劃資助項目(2017YFD0100403)；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金資助項目[CX(18)2022]；江蘇省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)重點研發(fā)計劃資助項目(BE2017345)；國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(2018ZX0800102)；江蘇省自然科學(xué)基金資助項目(BK20170610)。