菌肥拌種對太子參生長及品質(zhì)的影響

任建國 王益 劉紅美

摘要：種植經(jīng)多功能菌肥拌種處理的太子參種根，收獲后分析太子參塊根長度、生物量及主要品質(zhì)指標(biāo)，以研究其對太子參生長發(fā)育和品質(zhì)的影響。結(jié)果表明，與未經(jīng)菌肥處理的對照相比，菌肥處理過的太子參塊根生物量明顯增加;塊根的氨基酸、皂苷含量及微量元素Mn、Fe含量分別增加243.3%、119.8%、2.1%和13.1%，而多糖、環(huán)肽含量及微量元素Cu、Zn含量差異不大。多功能菌肥的施用能改善太子參塊根的品質(zhì)，提高其藥用價值。

關(guān)鍵詞：太子參;菌肥;品質(zhì);生物量

中圖分類號：S567.5+30.6 ? 文獻標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）07-0116-04

太子參[Pseudostellaria heterophylla （Miq.） Pax]為一種藥食兩用的中藥材，含有多糖、環(huán)肽、氨基酸、皂苷、微量元素、揮發(fā)性成分等[1]，臨床上用于治療脾虛體倦、食欲不振、病后虛弱等癥，而作為保健食品的有復(fù)方太子參顆粒、太子參口服液（太子寶）、什錦太子參酥脆和姜汁太子參酥等[2]。菌肥是利用微生物的生命活動及代謝產(chǎn)物，為農(nóng)作物提供營養(yǎng)元素、生長物質(zhì)，以達到調(diào)控生長、提高產(chǎn)量、改善品質(zhì)、減少化肥使用量及提高土壤肥力的目的。菌肥在作物上的應(yīng)用較多，尤其是禾谷類作物，如水稻[3]、小麥[4-6]、玉米[7]等，而在經(jīng)濟作物煙草、茶及中草藥等[8]上應(yīng)用較少。左群等采用L9（34）正交試驗研究不同菌肥[恩益碧（NEB）母液、重茬一號和彤嬌菌肥]、不同施用量和不同施用方式（拌種、拌肥和直接施肥）對連作太子參產(chǎn)量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌肥的施用方式對太子參產(chǎn)量影響最明顯，其次為施肥量[9]。陸志平用由巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）、解磷細菌（Bacillus megaterium）、鉀細菌（Bacillus mucilaginosus）組成的復(fù)合菌劑增施于太子參種植中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌劑能夠提高太子參產(chǎn)量，但因不同劑量基肥和追肥的施用其增產(chǎn)效果有所不同[10]。上述所有文獻都沒有關(guān)于菌肥對太子參品質(zhì)影響的相關(guān)研究報道，為此本試驗就自制菌肥對太子參生長、品質(zhì)的影響進行相關(guān)研究，以期為菌肥在太子參種植中的推廣施用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料和試劑 自制太子參菌肥（未進行菌株鑒定）：由促生菌KTS-1-1（具有抗根腐病、解鉀功能，用字母A代表）、TR-10J（具有溶磷功能）、ATS-1-1（具有固氮功能）、ATR-2-3（具有固氮功能）、PTS-2-1（具有溶磷功能）組成的菌液[11];普通復(fù)合肥：西洋復(fù)合肥（貴州西洋肥業(yè)有限公司，總養(yǎng)分含量≥45%，氮 ∶ 磷 ∶ 鉀=13 ∶ 17 ∶ 15）;磷肥：鈣鎂磷（江西江磷磷肥有限公司，養(yǎng)分含量≥12%）;鉀肥：硫酸鉀（江蘇邳州蘇北肥料有限公司，氧化鉀含量≥50%）;

試劑：人參皂苷Rbl，購自北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司;L-亮氨酸、D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，購自中國藥品生物制品檢定所;其他試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器 contrAA700型火焰原子吸收光譜儀，德國耶拿公司;R-3型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士步琦公司;721分光光度計，上海第三分析儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 菌肥施用及太子參生物性狀測定 選取大小一致的健康種根作為種子進行種植，試驗設(shè)置菌肥拌種（處理）和非拌種（對照）2種處理，于2016年1月在貴州省施秉縣牛大場鎮(zhèn)中藥材種植基地進行。用3×108 CFU/mL菌肥液噴濕種根表面，風(fēng)干后再排種。每處理3次重復(fù)，小區(qū)面積為 10 m2（10 m×1 m），共6個小區(qū)。種植條件與常規(guī)生產(chǎn)模式相同，施用基肥量為300 kg/hm2普通復(fù)合肥、750 kg/hm2磷肥、150 kg/hm2 鉀肥。各處理用450 kg/hm2復(fù)合肥按1 kg ∶ 75 L兌水成稀肥液澆施，作為追肥。試驗期間其他管理條件相同。太子參收獲后，測量太子參塊根長度;將塊根烘干至恒質(zhì)量后測其干質(zhì)量。

1.2.2 塊根氨基酸含量測定 太子參收獲后采取不同處理小區(qū)的塊根樣品混合后，用重蒸水沖洗干凈，室溫晾干后置于60 ℃恒溫干燥箱烘干至恒質(zhì)量，研磨成粗粉后儲存于干燥器內(nèi)備用。塊根氨基酸含量的測定參考文獻[12]。取1.0 g塊根粗粉置于25 mL大試管中，加入20 mL 95%的乙醇，密塞;將試管置于70 ℃水浴鍋中保溫30 min，隨后取出25 mL大試管靜置冷卻至室溫，最后定容至25 mL;將上層清液用濾紙過濾，濾液即可用于測定氨基酸含量。每個處理重復(fù)3次。

取質(zhì)量濃度為0、1、5、10、15、20、25 μg/mL的亮氨酸（選取人體必須氨基酸之一的亮氨酸來表征塊根中總氨基酸的相對含量）溶液 1 mL，分別加入3 mL 0.1%茚三酮試劑（0.1 g茚三酮溶于100 mL 95%乙醇溶液）及0.1 mL 0.1%抗壞血酸，于沸水中保持 15 min，用95%乙醇補足失去的體積，于580 nm處測定吸光度后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

吸取樣品濾液1 mL，加入3 mL 0.1%茚三酮試劑及 0.1 mL 0.1%抗壞血酸，于沸水中保持15 min，用95%乙醇補足失去的體積，于580 nm處測定吸光度。根據(jù)樣品的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品液氨基酸含量，然后根據(jù)下式計算塊根氨基酸含量。

每克粗粉樣品中氨基酸含量=（ρ×V1）/（m×D1）。其中，ρ為樣品液中測得的氨基酸質(zhì)量濃度，μg/mL;V1為提取液的體積，本試驗為25 mL;m為粗粉質(zhì)量，g;D1為粗粉中干物質(zhì)含量，%。

1.2.3 塊根多糖含量測定 塊根多糖含量的測定參考文獻[13]，稍有改動。取10 g塊根粗粉，置于100 mL圓底燒瓶中，加入80 mL 80%乙醇在90 ℃下回流提取5次。藥渣中加入80 mL蒸餾水在90 ℃水浴鍋中提取1 h，趁熱過濾，藥渣加蒸餾水洗滌數(shù)次，洗液并入濾液，冷卻后移入100 mL容量瓶中，最后用蒸餾水定容備用。每個處理重復(fù)3次。

取2 mL質(zhì)量濃度分別為0、8、16、24、32、40 μg/mL的葡萄糖溶液于各試管中，加入1.0 mL 6%苯酚試液搖勻，再迅速滴加濃硫酸5.0 mL，搖勻后放置5 min，再在沸水浴中加熱 15 min，取出冷卻至室溫，于490 nm處測吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

吸取供試液0.5 mL置于具塞試管中，加入蒸餾水至 2.5 mL，另取2.5 mL蒸餾水作空白對照，各管均加入1.0 mL 6%苯酚試液搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0 mL，搖勻后靜置 5 min，再置于沸水浴中加熱15 min，冷卻至室溫，于490 nm處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可計算得供試液中葡萄糖的濃度，樣品中多糖含量計算公式：多糖的含量=C×D2×f×V2÷m1×100%。其中，m1為供試塊根質(zhì)量，μg;C為多糖稀釋液中葡萄糖的濃度，μg/mL;D2為多糖的稀釋因素（常數(shù)），V2為定容體積，mL;f為換算因素，常數(shù)。

1.2.4 塊根皂苷含量測定 塊根皂苷提取及含量測定參考文獻[14]，稍有改動。精密稱取太子參粗粉2.0 g，加20 mL蒸餾水稀釋，超聲提取30 min，緩緩加入乙醇，使含醇量達70%;靜置過夜，抽濾，減壓濃縮至干，以30 mL蒸餾水溶解殘渣，以60 mL水飽和的正丁醇分3次萃取，萃取液合并后再以50 mL正丁醇飽和的蒸餾水洗滌1次，減壓濃縮至干，殘渣以甲醇溶解并定容至10 mL，即得待測的總皂苷甲醇溶液。每個處理重復(fù)3次。

取100 ℃干燥至恒質(zhì)量的人參皂苷Rbl對照品10 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度配成標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)液10、20、40、80、160 μL，分別置于10 mL具塞試管中，用微熱風(fēng)吹去溶劑，加5%香草醛冰醋酸溶液 0.2 mL、高氯酸（70%～72%）0.8 mL，混勻后密塞。置60 ℃水浴中加熱 15 min 后立即用流水冷卻，加冰醋酸5 mL，搖勻，與空白對照均于560 nm波長處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精密移取所得皂苷的甲醇溶液50 μL，置于10 mL具塞試管中，用水浴鍋加熱除去溶劑，加5%香草醛冰醋酸溶液 0.2 mL、高氯酸（70%～72%）0.8 mL，混勻并密塞。置60 ℃水浴中加熱15 min后立即用流水冷卻，加冰醋酸5 mL，搖勻，與空白對照均于560 nm波長處測定吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線可得試液中總皂苷的濃度，再計算樣品中皂苷的含量。

1.2.5 塊根環(huán)肽含量測定 塊根環(huán)肽提取參考文獻[15]，稍有改動。稱取1.0 g干燥粉末樣品，用50 mL甲醇超聲提取45 min，過濾，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，用甲醇溶解定容至10 mL容量瓶中，使用0.45 μm微孔濾膜過濾，取濾液作為供試樣品溶液。

分別取濃度為200 μg/mL的亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于25 mL的具塞比色管中，加入1 mL pH值為6.8的磷酸緩沖液和1 mL茚三酮顯色劑（0.02 g/mL），于沸水中水浴15 min，取出置冷水中水浴15 min，加入5 mL的碘酸鉀（2 g/L），用蒸餾水定容至10 mL，搖勻。在576 nm波長下測定吸光度，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

環(huán)肽含量的測定參考文獻[16]，稍有改動。分別吸取6個250 μL的供試樣品溶液，向其中3個樣品溶液中加入 4 mL 1.2 mol/L的HCl，另3個中加入等量的蒸餾水，于90 ℃水解2 h，取出后用2 mol/L的NaOH中和加HCl的溶液至pH值在5～7之間，然后用蒸餾水定容至10 mL，搖勻后取1 mL于25 mL的比色管中，加入1 mL pH值為6.8的磷緩沖酸液和1 mL茚三酮顯色劑（0.02 g/mL），于沸水中水浴15 min，取出置冷水中水浴15 min，加入5 mL的碘酸鉀（2 g/L），用蒸餾水定容至10 mL，在576 nm波長下測定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得酸解后樣品溶液中亮氨酸濃度，減去未經(jīng)酸解（蒸餾水）亮氨酸濃度即可得經(jīng)環(huán)肽水解釋放出亮氨酸的量（間接反應(yīng)環(huán)肽含量），再通過換算獲得塊根中環(huán)肽（亮氨酸）含量的大小。

1.2.6 塊根微量元素含量測定 塊根中Zn、Fe、Cu、Mn含量測定參考文獻[17]，稍有改動。稱取4份樣品各0.100 0 g，置于50 mL燒杯中，加6 mL HNO3和2 mL H2O2放置過夜，于微波消解儀中消解，用蒸餾水清洗消解管，待冷卻至室溫后用蒸餾水定容至10 mL待分析用。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法分別測定Zn、Fe、Cu、Mn元素含量，在優(yōu)化工作條件[17]下對樣品進行測定。由標(biāo)準(zhǔn)曲線可得分析液中微量元素的濃度，再換算出樣品中微量元素的含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

采用Excel 2007、SAS 8.1軟件對本試驗數(shù)據(jù)進行分析統(tǒng)計。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌肥對太子參生物性狀的影響

由圖1可知，經(jīng)菌肥拌種處理（處理）的塊根平均長度與未經(jīng)菌肥處理（對照）的塊根平均長度差異不顯著，但在單個塊根干質(zhì)量方面，處理顯著高于對照表明，菌肥與化肥配施能增加單個塊根產(chǎn)量，有明顯的增產(chǎn)作用，這與張禮維等的研究結(jié)果[18-19]相似。另外，本試驗結(jié)果也表明，處理與對照在單個塊根質(zhì)量上的差異與菌肥拌種所起的作用相關(guān)。本試驗結(jié)果可為降低化學(xué)肥料污染、保證農(nóng)業(yè)可持續(xù)生產(chǎn)提供實踐方案。

2.2 菌肥對塊根氨基酸含量的影響

由圖2可知，處理和對照塊根中氨基酸含量分別為 18.24、5.31 mg/g，處理氨基酸含量約是對照的3.4倍，顯著高于對照;表明菌肥拌種處理能提高太子參塊根氨基酸含量。張桂華等用988生物菌肥拌種處理玉米魯原單22和登海11，與未經(jīng)拌種處理的玉米相比，其產(chǎn)量以及賴氨酸、粗蛋白、粗淀粉、粗脂肪含量均有增加[20]。左燁研究發(fā)現(xiàn)，菌肥與化肥配施對大棚辣椒產(chǎn)量和品質(zhì)[氨基酸、維生素C含量]提高效果明顯[21]。本試驗與上述試驗均表明，菌肥能改善作物產(chǎn)量和品質(zhì)。

2.3 菌肥對塊根多糖含量的影響

由圖3可知，處理和對照塊根的多糖含量分別為 8.31%、8.01%，處理的含量稍高于對照。田雪蓮等的研究表明，與使用化肥相比，微生物菌肥+化肥混施能提高番茄產(chǎn)量以及果實總糖含量，而株高、開展度、莖粗、維生素C含量、可溶性固性物含量、番茄紅素含量等指標(biāo)基本沒有改變[22]，本試驗在太子參塊根產(chǎn)量、糖含量方面的試驗結(jié)果與之相似，進而說明微生物菌肥在改善植物產(chǎn)量和品質(zhì)方面有正向的作用。

2.4 菌肥對塊根皂苷含量影響

由圖4可知，處理和對照塊根中皂苷含量分別為 2.22%、1.01%，兩者含量間存在顯著差異。前人的研究表明，耕作制度、施肥類型[23]、氮磷鉀（NPK）肥料用量[24]等均會影響植物體內(nèi)皂苷的含量，而本試驗則發(fā)現(xiàn)，菌肥的施用有助于提高常規(guī)施肥水平下太子參塊根皂苷的含量，這可為太子參優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)提供合理的栽培管理技術(shù)。

2.5 菌肥對塊根環(huán)肽含量的影響

由圖5可知，處理和對照塊根中環(huán)肽（亮氨酸）含量分別為0.007 43%、0.007 95%，處理的環(huán)肽（亮氨酸）含量略低于對照。表明微生物菌肥的施用并不一定有助于植物特定化學(xué)成分含量的提高，這與Kandeel等的研究結(jié)果[25]相似。

2.6 菌肥對塊根微量元素含量的影響

表1表明，處理的微量元素Mn、Fe含量顯著高于對照，而二者Cu、Zn的含量差異不顯著，說明菌肥處理對太子參塊根中微量元素Mn、Fe的含量有提升作用。Yildirim等聯(lián)合應(yīng)用根際促生菌和氮肥來研究其對結(jié)球甘藍（Brassica oleracea var. capitata L.）生長、產(chǎn)量和化學(xué)組分的影響，結(jié)果表明，與未施用微生物的對照相比，促生菌的施用（浸種或幼苗沾根）對植株生長、產(chǎn)量以及體內(nèi)營養(yǎng)元素N、Na、K、Ca、Mg、P、Fe、Cu、M、Zn的含量增加均有促進作用，這種促進作用因營養(yǎng)元素和促生菌施用方法的不同而有所不同，一般來說，通過促生菌幼苗沾根處理的植株葉片營養(yǎng)元素含量大于浸種處理，而Cu、Zn則通過浸種處理獲得最大含量，Mn含量則表現(xiàn)為由于促生菌的處理而下降[26]。本試驗所得到的太子參塊根Mn、Cu、Zn含量變動情況與之不同，其原因可能與施用的促生菌種類、植物種類、化學(xué)肥料等多個因素有關(guān)。

3 結(jié)論與討論

本試驗結(jié)果表明，在太子參常規(guī)種植中（施用化學(xué)肥料），增加菌肥拌種處理措施不僅能提高太子參生物量，還對太子參品質(zhì)（氨基酸、皂苷、多糖含量及微量元素Mn、Fe含量）有改善作用，這與黃冬壽在太子參上施用菌肥的研究結(jié)果[27]相似。除此之外，菌肥的拌種增產(chǎn)效果在其他作物，如小麥[28]、青稞以及豌豆等[29]上均有報道。在所有這些研究報道中，菌肥拌種對植物產(chǎn)生的促生作用與菌肥功能微生物在土壤地力和肥料養(yǎng)分利用率方面的改善是分不開的[30]。而本試驗結(jié)果顯示的菌肥促生功能，與菌肥中不同功能微生物的固氮、溶磷、解鉀、抑制太子參根腐病原菌的作用[11]密不可分。

菌肥的增施不但能穩(wěn)定植物產(chǎn)量，且對植物品質(zhì)也產(chǎn)生一定的影響。如木霉屬（Trichoderma）菌肥與適當(dāng)比例的N、P、K復(fù)合肥配合施用能獲得高于單施N、P、K復(fù)合肥的番茄產(chǎn)量，且使果實品質(zhì)（全糖、維生素C、β-胡蘿卜素、番茄紅素等含量）有所改善[31]。而范新翔等的研究結(jié)果表明，菌肥拌種不僅能促進辣椒和小白菜植株生長、根系發(fā)達、根莖加粗、分枝數(shù)增加、開花提前和花蕾數(shù)增多等，而且對提高產(chǎn)量和改善品質(zhì)也有明顯效果[32]。Su等對經(jīng)過印度梨形孢（Piriformospora indica）處理的歐洲油菜（Brassica napus L.）植株的品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)進行測定，結(jié)果表明，印度梨形孢能增加N、Ca、Mg、P、K、S、B、Fe、Zn元素的含量，但降低芥子酸、芥子油甙的含量，進一步的實時定量PCR分析結(jié)果表明，與芥子酸合成相關(guān)的2個代謝酶基因Bn-FAE1和BnECR的表達量下調(diào)[33]。在本試驗中，菌肥拌種對太子參品質(zhì)有改善作用，可提高太子參塊根氨基酸、多糖、皂苷、Mn、Fe含量，但其具體的作用機制有待進一步研究。

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