糞菌移植治療非酒精性脂肪性肝病研究進(jìn)展

薛蘭鳳，羅文輝，何興祥，張發(fā)明，陳 羽

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease, NAFLD）包括非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis, NASH）及非酒精性脂肪性肝硬化，是目前最常見的慢性肝病之一[1]。在腸道菌群、飲食、遺傳、肥胖等各方面病因的綜合作用下，NAFLD可從單純性脂肪肝演變?yōu)楦卫w維化、肝硬化，甚至可進(jìn)展為肝癌[2]。迄今為止，尚無治療NAFLD的特效藥。據(jù)預(yù)測(cè)，至2030年NAFLD將成為肝移植最常見的適應(yīng)證[3]。因此，改變生活方式，包括體育鍛煉、健康飲食和減肥，通常被推薦作為改善及預(yù)防NAFLD進(jìn)展為肝纖維化、肝硬化甚至肝癌的主要臨床治療手段。然而，由于依從性差，無法達(dá)到預(yù)期療效的患者比例較大，能夠達(dá)到足夠減肥效果的患者較少，長(zhǎng)期維持體質(zhì)量的患者更少。因此，尋找新的有效的治療策略是治療NAFLD的迫切醫(yī)學(xué)問題。

近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群在NAFLD發(fā)病中扮演了重要角色[4-7]。當(dāng)腸道菌群生態(tài)平衡受到破壞時(shí)，腸道菌群通過激活病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns, PAMPs）、損傷相關(guān)分子模式（damageassociated molecular patterns, DAMPs）、肝星形細(xì)胞以及庫夫細(xì)胞相關(guān)通路，影響NAFLD的進(jìn)展，導(dǎo)致肝損害。因此，糾正腸道菌群失調(diào)可能成為NAFLD的治療方法。雖然目前已有各種口服的益生菌制劑用于糾正菌群紊亂，但由于菌種單一、菌量少、菌活力低下等原因使得治療效果有限。糞菌移植（fecal microbiota transplantation, FMT）是近年來發(fā)展起來的一種新型的治療多種疾病的方法。與口服制劑相比，F(xiàn)MT具有以下優(yōu)勢(shì)：①移植菌群種類豐富；②移植菌群數(shù)量龐大；③最大限度保留原有功能菌。故FMT能顯著改善腸道細(xì)菌紊亂，是目前公認(rèn)的恢復(fù)腸道微生態(tài)平衡最有效的方法。FMT對(duì)NAFLD的治療作用已在多項(xiàng)動(dòng)物和臨床研究中得到陽性評(píng)價(jià)[8-11]。肝性腦病是重型肝炎的十大防治并發(fā)癥之一，研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MT亦可顯著改善肝性腦病病情[12-13]。因此，F(xiàn)MT治療可能通過改變腸道菌群的組成譜，增加腸道健康菌群的豐度，抑制腸道菌群的過度生長(zhǎng)，修復(fù)腸道屏障通透性，進(jìn)一步改善NAFLD患者的病程。然而，F(xiàn)MT治療NAFLD的臨床應(yīng)用前景仍須進(jìn)一步驗(yàn)證，同時(shí)其潛在的分子機(jī)制尚不清楚。本文綜述了FMT治療NAFLD的實(shí)驗(yàn)和臨床證據(jù)，并總結(jié)其可能通路的作用機(jī)制。

1 FMT的概念和歷史

FMT是一種細(xì)菌療法，是將健康個(gè)體的糞便菌群移植到受體體內(nèi)的過程，是恢復(fù)腸道微生物多樣性的有效策略。FMT最早可追溯到公元4世紀(jì)的中國古代，“黃湯”被成功地用于治療嚴(yán)重食物中毒和腹瀉[14]?？v觀中國古代醫(yī)學(xué)發(fā)展進(jìn)程，有不少關(guān)于人類糞便治療多種消化道疾病的病例。然而，F(xiàn)MT的治療作用一開始在西方國家并沒有得到太多的認(rèn)可，被認(rèn)為是一種令人惡心的“偏方”。2013年，F(xiàn)MT被寫入美國治療難治性復(fù)發(fā)性難辨梭狀芽孢桿菌感染臨床指南[15]，這標(biāo)志著FMT得到了傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的認(rèn)可。除了治療難辨梭狀芽孢桿菌感染，F(xiàn)MT的應(yīng)用前景廣闊，包括治療代謝疾病、腫瘤免疫、肝性腦病等。研究表明，腸道菌群失衡可導(dǎo)致或加重肝細(xì)胞脂肪變性和肝炎[16-18]。近年，腸道菌群已成為一個(gè)世界性的研究熱點(diǎn)。

2 關(guān)鍵的解剖結(jié)構(gòu)和生理功能——肝-腸軸

肝-腸軸是腸道和肝臟相互聯(lián)系的關(guān)鍵橋梁，是腸道細(xì)菌影響肝功能的主要途徑。從解剖學(xué)上講，肝臟70%的血供來自門靜脈，肝臟與腸道的接觸主要是通過門靜脈系統(tǒng)，這使得肝臟容易受到腸道細(xì)菌及其內(nèi)毒素的影響[19]。在生理功能上，一方面，從食物中分解的物質(zhì)、次級(jí)膽汁酸、腸道細(xì)菌分解物等代謝產(chǎn)物可被吸收入血液，流入門靜脈，然后到達(dá)肝臟；另一方面，肝臟產(chǎn)生的膽汁酸、IgA和抗菌分子等物質(zhì)可分泌到膽道到達(dá)腸道。同時(shí)，肝臟炎癥介質(zhì)（如IL-1β、三甲胺氧化物等）和腸道代謝產(chǎn)物（如乙醛、丁酸、乙醇等）都可以滲透進(jìn)入循環(huán)，肝臟和腸道功能通過上述方式形成雙向溝通[20]。這些解剖結(jié)構(gòu)和生理功能的存在形成了肝-腸軸，當(dāng)腸道菌群受到破壞時(shí)，有害細(xì)菌產(chǎn)生的有毒物質(zhì)通過上述途徑進(jìn)入肝臟，導(dǎo)致肝功能受損。FMT可以削弱腸道內(nèi)的有害細(xì)菌，減少毒素進(jìn)入肝-腸軸的數(shù)量，從而防止對(duì)肝臟的進(jìn)一步損害。因此，肝-腸軸是FMT治療NAFLD的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。

3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探索了FMT對(duì)NAFLD的潛在治療作用（見表1）。Le Roy等[21]的一項(xiàng)研究中，2只體質(zhì)量相等，對(duì)高脂飲食（high fat diet,HFD）反應(yīng)不同的雄性C57BL/6J小鼠予以HFD飼養(yǎng)，經(jīng)一段時(shí)間后，對(duì)HFD分別產(chǎn)生應(yīng)答和無應(yīng)答的效果?！皯?yīng)答者”出現(xiàn)高血糖，血漿中促炎細(xì)胞因子濃度較高；而“無應(yīng)答者”血糖正常，全身炎癥程度較低。將上述2只小鼠的糞便經(jīng)胃內(nèi)灌入8周齡無菌小鼠體內(nèi)，分為應(yīng)答者組（n=22）和無應(yīng)答者組（n=18），再予喂養(yǎng)相同的HFD 16周。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管所有無菌小鼠都出現(xiàn)了類似的肥胖，但應(yīng)答者組出現(xiàn)了高血糖、胰島素抵抗及肝臟脂肪變性，而無應(yīng)答者組則沒有。此外，通過16S rRNA測(cè)序，2組無菌小鼠的腸道細(xì)菌在門、屬、種水平上存在差異。

Zhou等[8]將無致病性雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、HFD組和HFD+FMT組（每組12只）。對(duì)照組和HFD組分別采用標(biāo)準(zhǔn)飲食與HFD喂養(yǎng)16周，HFD+FMT組則先采用HFD喂養(yǎng)16周，再予FMT治療8周（收集對(duì)照組的糞便，采用灌胃法進(jìn)行FMT）。16周后與對(duì)照組相比，HFD組和HFD+FMT組的腸通透性和肝脂肪變性增加；HFD+FMT組再予FMT飼養(yǎng)8周后，與HFD組相比，腸道通透性和肝脂肪變性明顯降低。研究表明，F(xiàn)MT可通過調(diào)節(jié)腸道菌群，減輕HFD誘導(dǎo)的小鼠脂肪性肝炎。

Soderborg等[22]將孕婦分為肥胖組（n=8）和正常體質(zhì)量組（n=7），分別收集2組孕婦的2周大嬰兒的糞便，用于喂養(yǎng)2組無菌 C57BL/6J小鼠21 d（n=12）。研究結(jié)果顯示，用肥胖組嬰兒糞便喂養(yǎng)的小鼠出現(xiàn)超重現(xiàn)象，且腸道通透性增加，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和固有免疫相關(guān)的肝基因表達(dá)增加，門靜脈的炎癥明顯，而用正常體質(zhì)量組嬰兒糞便喂養(yǎng)的小鼠則沒有出現(xiàn)該現(xiàn)象。表明母親的肥胖可能通過菌群影響了嬰兒的肥胖和NAFLD的發(fā)病。

García-Lezana等[23]用高脂高糖飲食和對(duì)照飲食喂養(yǎng)Sprague-Dawley大鼠8周，選擇具有代表性的大鼠作為腸道菌群供體。研究者將對(duì)照組供體糞便移植到上述高脂高糖飲食的大鼠體內(nèi)，維持12～14 d。研究者觀察到，高脂高糖組大鼠出現(xiàn)肥胖、胰島素抵抗、無纖維化的NASH、門靜脈高壓、肝內(nèi)內(nèi)皮功能障礙和腸道菌群失調(diào)。經(jīng)過對(duì)照組供體FMT后，盡管高脂高糖組大鼠NASH病情沒有顯著變化，但顯著降低了門靜脈高壓。此外，高脂高糖組大鼠體質(zhì)量明顯下降，胰島素抵抗得到改善。這些結(jié)果表明，F(xiàn)MT可能是治療NASH門靜脈高壓癥的一種選擇。

表1 FMT治療NAFLD的相關(guān)研究Table 1 Experiments on FMT in the treatment of NAFLD

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腸道菌群在機(jī)體代謝中起著重要作用，腸道菌群紊亂可導(dǎo)致多種代謝疾病的發(fā)生，如脂肪肝、肥胖、胰島素抵抗等。FMT將健康個(gè)體的腸道菌群移植到患有代謝性疾病的動(dòng)物腸道中，可以原位平衡腸道菌群，改善代謝性癥狀，甚至可以減少肝臟的脂肪沉積。

4 FMT治療NAFLD的可能分子機(jī)制

基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)FMT可用于治療NAFLD。然而，其背后的分子機(jī)制還處于探索階段，尚未完全明確。如前所述，PAMPs和DAMPs的激活是導(dǎo)致肝損傷的主要致病途徑。根據(jù)現(xiàn)有的研究成果，推測(cè)其可能通過以下機(jī)制發(fā)揮作用。

4.1 轉(zhuǎn)變腸道菌群構(gòu)成，減少產(chǎn)內(nèi)毒素菌并增加益生菌 脂多糖（lipopolysaccharides, LPS）又稱內(nèi)毒素，是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，是增加腸道屏障通透性，激活腸道免疫細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致自身免疫性腸道炎癥發(fā)生的主要致病物質(zhì)。NAFLD患者腸道菌群往往呈現(xiàn)革蘭陰性桿菌增多的特點(diǎn)。FMT通過移植健康者體內(nèi)的整體菌群，轉(zhuǎn)變患者腸內(nèi)原腸菌構(gòu)成，使產(chǎn)LPS菌減少，降低血清內(nèi)毒素水平和減輕LPS引起的炎癥反應(yīng)，再次恢復(fù)腸道菌群生態(tài)平衡。與此同時(shí)，LPS可通過肝-腸軸與肝表面受體結(jié)合［如Toll樣受體（Toll-like receptor, TLR）4、IL-17r］，激活免疫細(xì)胞分泌炎癥因子（如TNF-α、IL-6、IL-1β），進(jìn)一步啟動(dòng)肝臟炎癥反應(yīng)[24]。從健康人糞便中提取完整的糞菌予移植，轉(zhuǎn)變患者腸道菌群構(gòu)成，可減少內(nèi)毒素的產(chǎn)生和內(nèi)毒素介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，維持腸道菌群的生態(tài)平衡。

另外，F(xiàn)MT還可使乳酸桿菌等益生菌比例增加。這些益生菌可發(fā)酵產(chǎn)生丁酸鹽等一些重要代謝產(chǎn)物，參與物質(zhì)合成與分解，促進(jìn)機(jī)體代謝平衡。丁酸鹽為一種短鏈脂肪酸，是免疫調(diào)節(jié)劑和抗炎物質(zhì)，具有保護(hù)腸黏膜屏障、調(diào)節(jié)免疫功能、增加胰島素受體敏感性等作用[25-29]。Zhang等[30]研究發(fā)現(xiàn)，將健康人體內(nèi)提取的產(chǎn)丁酸鹽菌移植入動(dòng)物模型中，其腸內(nèi)炎癥反應(yīng)明顯改善，提示產(chǎn)丁酸鹽菌具有抗炎作用。另外，還有一些研究表明丁酸鹽是保持腸道屏障和免疫調(diào)節(jié)的基本條件[28，31]。除了丁酸鹽外，益生菌還可產(chǎn)生其他許多保護(hù)機(jī)體的代謝物質(zhì)。因此，F(xiàn)MT可轉(zhuǎn)化腸道菌群構(gòu)成，使得益生菌及其有利代謝物增加，改善腸道屏障功能，減少致病因子進(jìn)入肝-腸軸，減輕肝內(nèi)炎癥反應(yīng)。

4.2 增加緊密結(jié)合蛋白和丁酸鹽，修復(fù)腸黏膜屏障 腸黏膜屏障能夠有效防止腸內(nèi)的有害物質(zhì)如細(xì)菌和毒素穿過腸黏膜進(jìn)入血液循環(huán)和人體組織。腸上皮細(xì)胞間緊密連接的腸道機(jī)械屏障受到破壞，腸黏膜通透性增加，LPS更易透過被破壞的腸黏膜屏障進(jìn)入門靜脈，經(jīng)肝-腸軸到達(dá)肝臟。Zhou等[8]將正常小鼠的糞便移植到HFD誘導(dǎo)的NAFLD小鼠模型體內(nèi)，經(jīng)8周的FMT治療后，NAFLD小鼠不僅腸內(nèi)乳酸菌等有益菌含量及丁酸鹽成分增加，而且腸道緊密結(jié)合蛋白ZO-1水平也有所提升，血清LPS水平降低，同時(shí)肝內(nèi)脂質(zhì)沉積、炎癥因子明顯減少。這提示FMT可通過增加腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)，降低腸黏膜通透性，起到修復(fù)機(jī)械屏障的作用。另外，F(xiàn)MT亦增加產(chǎn)丁酸鹽菌，而丁酸鹽能夠增強(qiáng)腸黏膜免疫屏障作用，從而阻止細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物等進(jìn)入血液引起炎癥反應(yīng)。Smith等[28]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證明，飲用含有丁酸鈉水的無菌小鼠腸黏膜Treg細(xì)胞數(shù)量增加，并且增強(qiáng)了Treg細(xì)胞對(duì)炎癥抑制因子IL-10的合成作用。除此之外，丁酸鹽亦能夠通過調(diào)控G蛋白偶聯(lián)受體、NF-κB、JAK/STAT等炎癥相關(guān)通路的活性，減少促炎細(xì)胞因子的釋放，抑制腸道的炎癥反應(yīng)，維持腸道免疫平衡[32-33]，增強(qiáng)腸黏膜免疫屏障功能?？傊?，F(xiàn)MT可通過增強(qiáng)腸黏膜機(jī)械屏障和免疫屏障，改善NAFLD患者病情。

4.3 增加肝內(nèi)胰島素受體表達(dá)，改善胰島素抵抗 胰島素抵抗是肝臟脂質(zhì)代謝紊亂的發(fā)生機(jī)制之一，通過影響脂質(zhì)代謝加重肝內(nèi)脂質(zhì)沉積。因此，增加胰島素受體表達(dá)，增強(qiáng)胰島素敏感性，可改善肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積，減少脂質(zhì)氧化應(yīng)激引起的炎癥反應(yīng)。Jin等[33]研究表明，給NASH小鼠補(bǔ)充丁酸鹽后，其肝內(nèi)胰島素受體表達(dá)顯著增加，可提高胰島素敏感性，進(jìn)而改善脂質(zhì)代謝。FMT可增加腸道產(chǎn)丁酸鹽菌的比例，該研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了FMT可能通過增加丁酸鹽來促進(jìn)胰島素受體的表達(dá)。另外，Zhou等[8]的研究也發(fā)現(xiàn)FMT后腸代謝產(chǎn)物丁酸鹽明顯增加，且隨著丁酸鹽濃度的增加，肝內(nèi)炎癥前反應(yīng)因子 TNF-α、MCP-1、IL-1、IL-6等顯著減少、調(diào)節(jié)脂代謝和胰島素敏感性相關(guān)基因（PPAR-α、PPAR-γ）增加，而肝內(nèi)甘油三酯和膽固醇較FMT前減少。該結(jié)果進(jìn)一步提示FMT可增加胰島素敏感性這一觀點(diǎn)的可靠性。因此，F(xiàn)MT可通過增加產(chǎn)丁酸鹽菌來提高肝內(nèi)胰島素受體的表達(dá)，從而改善胰島素抵抗，減輕肝細(xì)胞脂肪沉積，維持脂質(zhì)代謝平衡。

4.4 FMT減少DAMPs的活化和遷移 DAMPs是細(xì)胞或組織損傷時(shí)釋放至損傷部位的一系列炎癥反應(yīng)因子，如高遷移率族蛋白B1、S100蛋白、核DNA等，是非感染性炎癥反應(yīng)發(fā)生的主要機(jī)制[24]，是參與NAFLD發(fā)病的機(jī)制之一。在NAFLD中，當(dāng)肝免疫細(xì)胞接收來自肝細(xì)胞死亡或腸道損傷信號(hào)后（如LPS與肝免疫細(xì)胞表面的受體結(jié)合），活化的免疫細(xì)胞將DAMPs分泌至細(xì)胞外，遷移至病灶，與其相應(yīng)受體結(jié)合加重肝內(nèi)炎癥反應(yīng)[34]。只要損傷信號(hào)不解除，其引起的炎癥作用就持續(xù)存在，這也是NAFLD發(fā)病的重要環(huán)節(jié)之一。DAMPs可與晚期糖基化終末產(chǎn)物受體或TLRs結(jié)合，參與炎癥反應(yīng)過程以及NAFLD的發(fā)生、發(fā)展[34]。

LPS和DAMPs存在相同的受體，而FMT治療可減少LPS產(chǎn)生，起到減少相關(guān)免疫細(xì)胞損傷信號(hào)的作用，隨之分泌至胞外的DAMPs亦減少。另外，F(xiàn)MT可使TLR4受體及下游信號(hào)通路的MYd88蛋白水平下調(diào)，抑制TGF-β1和α-SMA的表達(dá)，因此可與DAMPs結(jié)合的受體亦相應(yīng)減少[8，34]。即FMT可通過減少LPS及下調(diào)DAMPs受體水平，減輕或阻斷持續(xù)炎性浸潤(rùn)，改善肝臟損害。

5 總 結(jié)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，腸道菌群在NAFLD發(fā)生、發(fā)展中扮演了重要的角色，F(xiàn)MT可通過降低炎癥反應(yīng)、修復(fù)腸道機(jī)械屏障和免疫屏障、上調(diào)胰島素受體水平、改善胰島素抵抗、減弱PAMPs和DAMPs的活化和遷移等途徑，改善NAFLD患者的病情。因此，F(xiàn)MT可能成為基于肝-腸軸的NAFLD特異治療方式之一。然而，該方式目前仍處于基礎(chǔ)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，有待臨床應(yīng)用研究結(jié)果的進(jìn)一步證實(shí)。