質(zhì)譜對(duì)甲氧西林耐藥和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌的鑒定價(jià)值

吳文強(qiáng)，仇玉蘭

(山西醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院， 太原 030001)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 是臨床常見(jiàn)高毒性致病菌之一，通過(guò)釋放多種細(xì)胞外毒素，如腸毒素、溶血素、殺白細(xì)胞毒素等而表現(xiàn)出較強(qiáng)的致病力[1]。多見(jiàn)于醫(yī)源性感染、社區(qū)獲得性感染等病灶中，以皮膚及軟組織感染最為常見(jiàn)，但也能作為敗血癥、中毒性休克等疾病的致病菌[2]。MRSA被認(rèn)為是“超級(jí)病菌”之一，感染后難于控制。因此，準(zhǔn)確及時(shí)地鑒別MRSA和MSSA，監(jiān)測(cè)MRSA的流行情況，對(duì)于及時(shí)向臨床提供治療方案和控制感染極為重要。

臨床上常用的用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌耐藥表型的方法有紙片擴(kuò)散法、肉湯稀釋法、Etest 方法等，這些方法需對(duì)細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)18～24 h來(lái)觀察結(jié)果，耗時(shí)較長(zhǎng)。質(zhì)譜技術(shù)因其鑒定速度快、準(zhǔn)確率高的特點(diǎn)而引起廣泛重視。近年來(lái)，MALDI-TOF-MS 已經(jīng)成功應(yīng)用于細(xì)菌的快速鑒定和耐藥性研究[3]，例如檢測(cè)耐藥株和敏感株指紋圖譜的改變[4-5]。已有部分研究將 MADLI-TOF MS 用于鑒定MRSA，有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) MRSA 和 MSSA 在500～3 500 m/z范圍內(nèi)的質(zhì)譜峰存在差異[6-7],但是沒(méi)有探討質(zhì)譜特異峰對(duì)鑒定MRSA和 MSSA的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次研究選取2017年3月—2018年2月期間在本院接受治療的患者1153例；男595例，女558例，年齡22～75歲，年齡平均(44.25±10.95)歲；來(lái)自骨科、呼吸內(nèi)科、外科及皮膚科等多個(gè)科室。納入標(biāo)準(zhǔn)：① 入院后接受血尿常規(guī)、血生化檢驗(yàn)，結(jié)合影像學(xué)檢查，明確相應(yīng)診斷；② 患者意識(shí)清楚，無(wú)精神疾病；③ 所有患者均對(duì)本次研究?jī)?nèi)容知情同意，自愿參與，并同醫(yī)院簽訂知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 哺乳、妊娠以及準(zhǔn)備妊娠的女性患者；② 心肝腎等重要臟器嚴(yán)重疾病、血液系統(tǒng)疾病、傳染性疾病、腫瘤患者；③ 診療依從性較差，無(wú)法判定療效，或因資料不全導(dǎo)致影響療效的判斷者。

1.2 方法

所有患者均收集體液、血液及壞死性組織等樣本，并進(jìn)行檢測(cè)，分離出致病菌后，利用全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)最終確定為金黃色葡萄球菌。經(jīng)質(zhì)譜儀鑒定后，聯(lián)合ClinPro Tools軟件建立模型[8]分析MRSA及MSSA質(zhì)譜圖差異，并驗(yàn)證質(zhì)譜圖特征峰對(duì)MRSA和MSSA的鑒定價(jià)值。

1.2.1樣本收集

患者需在清晨空腹?fàn)顟B(tài)下收集體液(包括痰液、尿液及分泌物以及血液)。清水漱口后用力咯痰，將痰液樣本置于無(wú)菌容器內(nèi)，送檢實(shí)驗(yàn)室。尿液需在碘伏棉球清潔外陰后，取第1次排尿的中段尿，置于無(wú)菌容器內(nèi)，送檢實(shí)驗(yàn)室。分泌物收集分2種：一為陰道分泌物，患者均為女性，所有受檢者均在采集樣本前72 h避免性生活，將一次性采樣拭子送入宮頸口后采集樣本；二為皮膚分泌物，經(jīng)無(wú)菌操作規(guī)則，刮刀或勺體采集分泌物。常規(guī)皮膚消毒后，靜脈穿刺取外周循環(huán)血液樣本8～10 mL至血培養(yǎng)瓶后送到實(shí)驗(yàn)室。常規(guī)皮膚消毒后，經(jīng)皮穿刺或支氣管鏡穿刺獲取體內(nèi)組織樣本，皮膚組織樣本在無(wú)菌操作規(guī)則下，經(jīng)無(wú)菌刮刀通過(guò)皮膚刮擦獲取樣本。

1.2.2微生物鑒定以及體外藥敏試驗(yàn)

所有樣本經(jīng)35 ℃培養(yǎng)24 h后，分離出致病菌，并利用法國(guó)生物梅里埃VITEK2-Compact全自動(dòng)微生物鑒定以及藥敏系統(tǒng)(生物梅里埃股份有限公司生產(chǎn))GP卡片和GP67卡片進(jìn)行鑒定。以ATCC29213金黃色葡萄球菌為標(biāo)準(zhǔn)菌株，對(duì)儀器進(jìn)行質(zhì)量控制。以苯唑西林MIC值≥4 μg/mL為MRSA，苯唑西林MIC≦2 μg/mL為MSSA作為判定標(biāo)準(zhǔn)[9]，共分離出MRSA 58株，MSSA 42株。

1.2.3菌株保存

將分離到的金黃色葡萄球菌菌株各自編號(hào)，用無(wú)菌濾紙收集后凍存于-80 ℃冰箱中。

1.2.4樣品制備和質(zhì)譜分析

隨機(jī)選取26株MRSA和19株MSSA，將凍存的菌落接種于羊血瓊脂培養(yǎng)皿，35 ℃孵育過(guò)夜，并按照Bruker 公司給出的標(biāo)本前處理指南用乙醇-甲酸法提取MRSA和MSSA的核糖體蛋白。質(zhì)譜儀采用反射正離子模式，使用大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行曲線校正，40%激光強(qiáng)度，檢測(cè)器范圍為2 000～20 000 m/z，通過(guò)利用 Flex Control version 3.0 software(Bruker)軟件采集質(zhì)譜圖，每個(gè)靶點(diǎn)采集一張質(zhì)譜圖。

1.2.5模型建立與驗(yàn)證

使用布魯克公司提供的Clinpro Tools(3.3.0版本)軟件(遺傳算法)建立模型并驗(yàn)證。建立ClinPro Tools模型，特異峰納入標(biāo)準(zhǔn)為:① 峰值在所有菌株中，分析分類值均>70%[10]，② 峰值強(qiáng)度>2 000。分析甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌及敏感金黃色葡萄球菌特征圖譜重合率、峰質(zhì)荷比。利用其他32株MRSA和23株MSSA對(duì)此模型進(jìn)行驗(yàn)證，經(jīng)與MIC法比對(duì)，評(píng)價(jià)特征峰值對(duì)區(qū)分MRSA與MSSA的鑒定價(jià)值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本次研究利用Excel軟件處理數(shù)據(jù)，利用百分比(%)表示計(jì)數(shù)資料，計(jì)算其靈敏度以及特異度。

2 結(jié)果

1 153例患者分離出金黃色葡萄球菌100株，其中，MRSA 58株(58.00%)，MSSA 42株(42.00%)。隨機(jī)抽取MRSA和MSSA分別為26株、19株建立ClinPro Tools模型后，根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)找到MRSA主要特征峰質(zhì)荷比共2個(gè)，即2 305.6Da以及3 007.3Da。利用其他32株MRSA和23株MSSA對(duì)此模型進(jìn)行驗(yàn)證。與MIC法比對(duì)，結(jié)果顯示特征峰1靈敏度71.9%，特異度82.6%；特征峰2靈敏度68.8%,特異度87%。將兩點(diǎn)聯(lián)合起來(lái)，靈敏度為90.6%，特異度為73.9%(表1)。

表1 質(zhì)譜法與MIC法比較的四格表

注：峰值1為2 305.6Da，峰值2為3 007.3Da，峰值3為2 305.6Da，聯(lián)合為3 007.3Da。

3 討論

由金黃色葡萄球菌引起的感染性疾病近幾年來(lái)在臨床上威脅越來(lái)越大，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，其耐藥菌株日益增多，特別是MRSA具有多重耐藥性，對(duì)常用的抗生素如大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖甙類、氯霉素和四環(huán)素等均表現(xiàn)出耐藥性[11]，在美國(guó)臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI) M100 S28文件中介紹，MRSA對(duì)所有β內(nèi)酰胺酶藥物均表現(xiàn)為耐藥[9]。需要注意的是，造成感染的金黃色葡萄球菌不僅包括MRSA，還包含MSSA[12],兩者治療方案不盡相同，合理使用抗生素可以延緩耐藥菌的產(chǎn)生。傳統(tǒng)病原菌微生物診斷方法具有耗時(shí)長(zhǎng)、流程復(fù)雜等局限性，而且診斷后存在一定的誤差率，不僅對(duì)微生物判斷產(chǎn)生一定的差錯(cuò)，還能影響診療方案的制定及臨床療效的判斷。因此，優(yōu)化以金黃色葡萄球菌為代表的病原微生物診療方案具有非常重要的臨床價(jià)值。

MRSA耐藥表型由染色體上的mecA基因介導(dǎo)。MRSA的檢測(cè)方法有很多種，如脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)分型、重復(fù)性基因外回文序列聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)分型、多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing，MLST)、葡萄球菌A蛋白(staphylococcal protein A，SPA)分型和葡萄球菌染色體mec基因(staphylococcal cassette chromosomemec，SCCmec)分型等[13]。這些方法均對(duì)MRSA亞型有良好的鑒定和區(qū)分能力[13-14]。但它們操作復(fù)雜、時(shí)間長(zhǎng)且成本較高，且PCR檢測(cè)mecA 基因的方法可以確定細(xì)菌是否存在mecA基因，但并不能完全確定細(xì)菌表現(xiàn)為耐藥，因?yàn)閙ecA基因編碼蛋白的量的多少也會(huì)影響到細(xì)菌耐藥性表型的差異[15]。

質(zhì)譜技術(shù)是目前臨床上應(yīng)用的優(yōu)質(zhì)鑒定方法之一，具有敏感性高、準(zhǔn)確率高及通量高等特點(diǎn)，能夠通過(guò)蛋白質(zhì)峰值的差異進(jìn)行細(xì)菌的判讀，廣泛應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)、食物檢驗(yàn)等領(lǐng)域中[16]。已有文獻(xiàn)指出，MALDI-TOF技術(shù)可成功用于MRSA的分子分型[8]，但需警惕樣本培養(yǎng)時(shí)間變化可能引起該樣本質(zhì)譜分析結(jié)果發(fā)生的變化[17]。

本文主要使用MALDI-TOF技術(shù)分析MRSA及MSSA特征圖譜重合率、峰質(zhì)荷比。本次研究共找到有意義的特征峰2個(gè)，MRSA主要特征峰質(zhì)荷比2個(gè)，2 305.6 Da和3 007.3 Da，MSSA主要特征峰質(zhì)荷比是6 816.7 Da。之后驗(yàn)證鑒定正確率，結(jié)果顯示特征峰1靈敏度71.9%，特異度82.6%；特征峰2靈敏度68.8%,特異度87%；將兩點(diǎn)聯(lián)合起來(lái)，靈敏度為90.6%，特異度為73.9%。其中單個(gè)標(biāo)本鑒定耗時(shí)10 min左右。該方案能夠在短時(shí)間內(nèi)快速區(qū)分MRSA與MSSA，具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

不足的是，本次試驗(yàn)樣本量有限，可能漏檢更有意義的特征峰；沒(méi)有嚴(yán)格控制峰強(qiáng)度，每株細(xì)菌只用質(zhì)譜儀鑒定一次，無(wú)法避免偶然錯(cuò)誤帶來(lái)的影響。