血清細(xì)胞骨架蛋白4檢測對肝細(xì)胞癌的診斷價值

朱錦舟，張慧嫻，奚黎婷，許春芳，吳愛榮

（蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院 消化內(nèi)科，江蘇 蘇州 215000）

原發(fā)性肝癌是世界第5、我國第3 最易導(dǎo)致患 者死亡的惡性腫瘤，我國每年因肝癌死亡約11 萬人，占全世界肝癌死亡人數(shù)50%[1]。根據(jù)病理學(xué)分類，原發(fā)性肝癌大多是肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）[2]。由于其發(fā)病早期無明顯癥狀，進(jìn)展迅速，出現(xiàn)癥狀確診時已達(dá)疾病晚期，多發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后差。因此，肝癌的早期篩查和監(jiān)測工作是重中之重[3]。甲胎蛋白（alpha fetoprotein,AFP）是HCC 最常見的血清標(biāo)志物，但在臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)AFP 對于早期肝癌的診斷價值有限，存在一定的假陽性及假陰性[2-3]。細(xì)胞骨架蛋白4（cytoskeleton-associated protein,CKAP4）是一種連接于微管和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ⅱ型跨膜蛋白，近年來的研究發(fā)現(xiàn)其功能上與細(xì)胞凋亡及胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)有密切的關(guān)系，被認(rèn)為是腫瘤診斷和治療的潛在靶點(diǎn)[4-5]。本研究旨在探討血清CKAP4 水平檢測對HCC 的臨床診斷意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2013年1月—2017年12月蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院HCC 患者88 例為HCC組，同期選取肝硬化患者91 例，慢性乙型肝炎患者87 例，門診體檢部健康體檢者81 例為3 個對照組。3組患者及健康體檢者的性別、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。參與者均知情并簽署知情同意書。

1.2 疾病診斷

1.2.1 HCC 診斷 首先經(jīng)影像學(xué)，如肝臟超聲或腹部CT 檢出，而后參照美國肝病研究學(xué)會（AASLD）的標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)超聲肝穿取組織病理證實(shí)HCC[2]。根據(jù)巴塞羅那肝癌分級標(biāo)準(zhǔn)（BCLC）[6]，將HCC 患者分期，其中0 期和A 期定義為早期HCC。

1.2.2 慢性乙型肝炎診斷 參照慢性乙型肝炎防治指南（2015年更新版）[7]，慢性乙型肝炎病毒感染需滿足乙肝表面抗原和/或病毒DNA 陽性6 個月以上。

1.2.3 肝硬化診斷 綜合考慮包括臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查、組織學(xué)、影像學(xué)及組織病理等依據(jù)。根據(jù)科技部重大專項(xiàng)課題指南[8]，肝活組織檢查作為金標(biāo)準(zhǔn)，即出現(xiàn)彌漫性肝纖維化伴假小葉形成。

1.2.4 健康體檢者符合條件 ①肝臟生化相關(guān)指標(biāo)無異常；②既往無肝病病史；③無其他系統(tǒng)性疾病或惡性腫瘤。

1.3 實(shí)驗(yàn)室檢測

在疾病診斷和體檢時一并收集患者及健康體檢者清晨空腹血。血樣收集后統(tǒng)一離心并置入-80℃冰箱冷凍保存。血生化檢查采用Hitachi 7600 全自動生物化學(xué)分析儀（韓國日立有限公司）。血清CKAP4 水平采用ELISA 試劑盒（No：CSB-EL005453HU，武漢華美生物工程有限司）。血清AFP 檢測采用ELISA 試劑盒（美國Abbott 公司）。實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行操作并重復(fù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 24.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）及中位數(shù)和四分位數(shù)M（P25，P75）表示，比較采用單因素方差分析或Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的兩組數(shù)據(jù)采用LSD-t檢驗(yàn)。受試者操作特征（receiver operating characteristics,ROC）曲線用于評價蛋白對HCC 識別能力，比較ROC 曲線下面積（AUC）、敏感性及特異性。最佳Cut-off 值根據(jù)約登指數(shù) 方法來確定。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC組患者一般資料

納入研究的88 例HCC 患者一般資料見表1。

表1 HCC 患者一般資料（n =88）

2.2 4組AFP 和CKAP4 水平比較

HCC組血清AFP 水平為143.2（27.9，265.4）ng/ml，健康體檢者血清AFP 水平為7.8（4.6，10.4）ng/ml，慢性乙型肝炎患者血清AFP 水平為30.5（21.1，48.7）ng/ml，肝硬化患者血清AFP 水平為30.9（21.6，51.4）ng/ml。4組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=69.410，P=0.000）。HCC組血清AFP 水平分別與健康體檢組、慢性乙型肝炎組、肝硬化組3 個組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.470，7.737 和7.849，均P=0.000），實(shí)驗(yàn)組高于其他3 個對照組。見圖1。

HCC組血清CKAP4水平為345.9（262.7，468.0）pg/ml，健康體檢者血清CKAP4 水平為162.1（96.6，246.5）pg/ml，慢性乙肝患者血清CKAP4 水平為162.0（75.5，266.2）pg/ml，肝硬化患者血清CKAP4 水平為209.5（109.5，292.8）pg/ml。4組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=58.110，P=0.000）。HCC組血清CKAP4 水平分別與健康體檢組、慢性乙型肝炎組、肝硬化組3 個組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.620，10.520 和8.616，均P=0.000），HCC組高于其他3 個對照組。見圖1。

2.3 AFP 與CKAP4 對HCC 的診斷價值

根據(jù)相關(guān)指南，選定20ng/ml 作為AFP 的Cut-off值，AUC 為0.796（95% CI：0.732，0.859），敏感性為0.795，特異性為0.425。根據(jù)約登系數(shù)原則，CKAP4 的Cut-off值為261.1 pg/ml，AUC 為0.843（95% CI：0.799，0.888），敏感性為0.761，特異性為0.737。兩者間AUC 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（chi2值=1.33，P=0.248）。見圖2。

2.4 AFP 與CKAP4 對早期HCC 的診斷價值

選擇20 ng/ml作為AFP的Cut-off值，判斷早期HCC 的AUC 為0.725（95% CI：0.638，0.813），敏感性為0.725，特異性為0.425。選擇261.1 pg/ml 作為CKAP4 的Cut-Off 值，判斷早期HCC 的AUC 為0.865（95% CI：0.814，0.915），敏感性為0.784，特異性為0.737。兩者間AUC比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（chi2值=7.03，P=0.008），CKAP4 優(yōu)于AFP。見圖2。

圖1 各組APF 和CKAP4 的循環(huán)濃度（±s）

圖2 以AFP 和CKAP4 繪制診斷HCC 和早期HCC 的ROC 曲線

3 討論

我國是肝病大國，其肝癌占全球發(fā)病總數(shù)超過一半[9]。由于肝癌早期癥狀隱匿、病程短、進(jìn)展快，發(fā)現(xiàn)時多已進(jìn)入進(jìn)展期，或合并遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后極差，5年生存率不足10%[1]。因此，對高危人群進(jìn)行定期篩查，及早診斷肝癌患者，對其治療和預(yù)后尤其關(guān)鍵[10]。

目前臨床實(shí)踐中，面對疑似HCC 的患者，主要是通過完善影像學(xué)檢查，包括超聲和CT，同時檢測血清AFP 水平來探討HCC 診斷可能的[2]。AFP 作為廣泛應(yīng)用的HCC 篩查和診斷的腫瘤生物標(biāo)志物，動態(tài)觀察其變化情況對早期診斷具有重要的臨床意義[3]。但AFP 在HCC 早期診斷存在2 個問題：其一是敏感性一般，AFP 水平與肝癌腫塊大小相關(guān)，腫塊過小時，AFP 常低于參考值，腫塊過大時，AFP 也會出現(xiàn)表達(dá)延遲，造成假陰性；其二是特異性差，AFP 不僅在HCC 患者外周血中升高，在慢性肝炎及肝硬化患者中也常有增高，造成假陽性[11]。臨床工作中就需要一種敏感性及特異性較均衡且穩(wěn)定的新型腫瘤標(biāo)志物運(yùn)用于HCC 的早期診斷。

CKAP4 又稱P63，是一種跨膜蛋白，作為細(xì)胞的一個受體，近年來被證實(shí)其與腫瘤細(xì)胞的異常行為特征密切相關(guān)。2014年LI 等[12]發(fā)現(xiàn)HCC 患者的肝癌組織中CKAP4 表達(dá)，與癌旁組織或正常肝組織相比，明顯上調(diào)。同時，CKAP4 的表達(dá)水平與腫瘤大小、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、門脈轉(zhuǎn)移及HCC 分期相關(guān)。此外，CKAP4還與患者整體預(yù)后及生存期相關(guān)。隨后，LI 等[13]在體外細(xì)胞水平及BALB/c 雄性裸鼠在體水平進(jìn)行試驗(yàn)證實(shí)CKAP4 是通過EGFR/Gab1/AKT 通路參與對HCC進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的調(diào)控。既往研究證實(shí)提示CKAP4 蛋白可通過外泌體形式釋放入外周循環(huán)中，可在血清和尿液中被檢測到[14-15]。

在本項(xiàng)研究中，首次報道運(yùn)用ELISA 試劑盒檢測多組慢性肝病患者血清中CKAP4 水平。通過對比和數(shù)據(jù)分析，本研究發(fā)現(xiàn)：與慢性乙型肝炎、肝硬化及健康體檢者比較，HCC 患者血清中CKAP4 水平升高；用于判斷HCC 患者，CKAP4 與AFP 無差異，但其特異性優(yōu)于AFP，彌補(bǔ)AFP 假陽性高的缺點(diǎn)；用于判斷早期HCC 患者，在保持較高敏感性的同時，CKAP4的準(zhǔn)確性和特異性優(yōu)于AFP。以上發(fā)現(xiàn)提示CKAP4可作為臨床實(shí)踐中HCC 早期篩查診斷的血清標(biāo)志物。

本研究是一項(xiàng)回顧性病例對照研究，因此今后多中心前瞻性隊(duì)列研究仍需設(shè)計并進(jìn)行，以期進(jìn)一步明確CKAP4 在HCC 發(fā)生、發(fā)展中的作用及臨床運(yùn)用價值。此外，需納入丙型肝炎病毒感染或酒精性肝病的患者，以及其他消化道腫瘤，如胃癌、肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌等，以此排除其他原因造成的假陽性現(xiàn)象。