穿山甲屬動物的DNA條形碼及在穿山甲商品鑒定中的應(yīng)用△

李嬋，謝雪那，蔡炫，張秋楠，田恩偉，晁志

南方醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510515

穿山甲為鯪鯉科動物穿山甲ManispentadactylaLinnaeus的鱗甲，始載于《名醫(yī)別錄》[1]，具通經(jīng)下乳、消腫排膿、搜風通絡(luò)之功，可用于經(jīng)閉癥瘕、乳汁不通、癰腫瘡毒、風濕痹痛、中風癱瘓、麻木拘攣[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，穿山甲在降低血液黏度、升高白細胞、鎮(zhèn)痛、抗炎和促使炎癥修復(fù)等方面也有重要作用[3]。

穿山甲以白蟻為食，生活習(xí)性特殊，繁育困難，迄今未能成功實現(xiàn)人工養(yǎng)殖，供應(yīng)完全依賴野生資源。近二三十年來，由于亂捕濫獵和棲息地的破壞，野生資源急劇減少，穿山甲藥材的供應(yīng)量大幅下降，價格日益增長，市場上出現(xiàn)從東南亞和非洲走私其他穿山甲屬物種的甲片替代入藥，以及多種其他摻假行為[4]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，藥材市場上，中華穿山甲M.pentadactyla、馬來穿山甲M.javanica、印度穿山甲M.crassicaudata、南非穿山甲M.temminckii、大穿山甲M.gigantea、樹穿山甲M.tricuspis和長尾穿山甲M.tetradactyla均有發(fā)現(xiàn)[5-6]。其他用于摻假的有豬、牛、羊的蹄甲等。為保證臨床用藥的安全有效，有必要對穿山甲的來源進行準確鑒定。

目前，過度捕獵和走私猖獗使穿山甲屬所有物種均瀕臨滅絕。世界自然保護聯(lián)盟《瀕危物種紅色名錄(2017)》將中華穿山甲和馬來穿山甲列為“極度瀕?！蔽锓N，將其他穿山甲物種列為“瀕危”或“易?！蔽锓N。2017年，8種穿山甲均被列入《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》(CITES)附錄一。穿山甲的準確鑒定也是保護穿山甲的必要條件。

目前，穿山甲常用的鑒別方法為性狀鑒別法，某些種類的穿山甲甲片的性狀極相似，即使有專業(yè)的技術(shù)與豐富的經(jīng)驗，也難以對其基原進行準確鑒定。另外有薄層色譜法、紅外光譜法、熒光分析法、離子色譜法、高效液相色譜法、高效毛細管電泳法等，這些方法多用在鑒別摻雜穿山甲、塑料制品、豬蹄甲等摻偽品[6-13]。與上述鑒別方法相比，DNA 分子技術(shù)不受樣品形態(tài)、數(shù)量等限制，對于其基原鑒定具有獨特的優(yōu)勢，因此近年來有不少研究者開始利用DNA分子鑒定法對穿山甲進行研究，如尹艷等[14]建立了穿山甲特異性多聚酶鏈式反應(yīng)(PCR)鑒別方法，邢亞琳等[15]運用cytb基因、12S rRNA基因、隨機擴增多態(tài)性DNA標記(RAPD)引物及微衛(wèi)星引物對穿山甲進行鑒定等。

DNA條形碼是目前公認可以對生物物種進行準確鑒定的技術(shù)。部分研究者應(yīng)用此方法對穿山甲進行了研究，如邢亞琳[16]的DNA條形碼研究中對3種穿山甲進行了分析；賈靜等[17]對中華穿山甲及混偽品豬、牛、羊進行分析，但均缺乏對穿山甲屬所有種及混偽品的全面分析。鑒于我國藥材市場穿山甲來源復(fù)雜多樣，利用DNA條形碼技術(shù)鑒別穿山甲藥材的基原，了解其商品流通的情況，對加強其質(zhì)量控制具有一定的意義。因此，為進一步充實穿山甲DNA條形碼鑒定的內(nèi)容，本研究基于COI序列探討DNA條形碼鑒定穿山甲屬及其他混偽品的可行性。

1 材料與方法

1.1 儀器

高速冷凍離心機(HC-3018R，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；電熱三用水箱(BOS2，北京市醫(yī)療設(shè)備廠)；電泳儀(DYY-6C，北京市六一儀器廠)；多功能暗箱式紫外分析儀(CBIO-UV6A1，北京賽百奧科技有限公司)；分析天平(ALC-210.4，ACCULAB)；自動振蕩器(MX-S，SCILOGEX)；PCR儀(2720，Applied Biosystem)；Nanodrop分光光度計(ND2000C，Thermo Fisher Scientific)；迷你筆型電磨筆(18 V，上海辰靈貿(mào)易有限公司)。

1.2 試劑

瓊脂糖(VetectM REAGENT grade Sigma-Aldrich，111860)；無水乙醇(天津市大茂化學(xué)試劑廠，20180801)；Proteinase K(TI ANGEN BIOTECH，R6830)；血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)(TIANGEN BIOTECH，R6725)；SuperRed/GelRed(Biosharp，68110160)；D2000(TIANGEN BIOTECH，MD114)；6×DNA loading buffer(TIANGEN BIOTECH，R6116)；2×TaqPCR MasterMix(TIANGEN BIOTECH，R6525)。

1.3 材料

本研究收集了中華穿山甲及其混偽品共計11個物種38份樣品，并從NCBI上下載了37條序列(均經(jīng)質(zhì)量檢驗，以確定下載序列與物種對應(yīng)關(guān)系的準確性[18-19])，具體信息詳見表1～2。中華穿山甲來自廣州市野生動物救護中心。實驗樣品均經(jīng)廣州市野生動物救護中心鄒潔建工程師和作者鑒定。另外，從各地藥店及藥企收集了35份穿山甲生甲片商品，具體商品信息詳見表3。

1.4 方法

1.4.1 DNA提取 穿山甲甲片和蹄甲類偽品用無水乙醇浸泡12 h，每3 h將乙醇換一遍，同時通過振蕩器輕輕振蕩清洗；之后以去離子水重復(fù)以上步驟。在60 ℃烘干，在紫外燈下正反面分別各照射滅菌30 min。[16]然后用已滅菌的刀片刮去角質(zhì)層的外層污染，取內(nèi)層，用小型電磨機磨成細粉。取細粉約0.2 g，在裂解步驟中加500 μL GA、100 μL二硫蘇糖醇(DTT)[20]、50 μL蛋白酶K，56 ℃水浴過夜，12 000 r·min-1離心2 min后取上清液，其余步驟按照血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN)說明書步驟提取樣品DNA。

舌頭及其他肌肉組織取約25 mg，按照血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN)說明書步驟提取樣品DNA。

表1 穿山甲及其混偽品樣品信息

表2 GenBanK下載的穿山甲及其混偽品的序列信息

表3 穿山甲商品信息表

1.4.2 PCR擴增及測序 采用COI序列通用引物MCOI-F(CAACAAATCACAAAGACATCGG)、MCOI-R(TTCTGGGTGTCCGAAAAATCA)[16]，對提取的DNA進行PCR擴增。擴增程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR反應(yīng)體積為15 μL，包含6 μL 2×TaqPCR Mix(TIANGEN)，正反向引物各0.5 μL[生工生物工程(上海)股份有限公司]，模板DNA 2 μL，ddH2O 6 μL補足體積至15 μL。實驗中設(shè)置無DNA模板的空白對照組。將PCR擴增產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行雙向測序。

1.4.3 序列分析 用DNASTAR軟件中的Seqman對所得序列進行拼接，去除引物區(qū)，并對堿基進行人工校對。將所有序列在MEGA(6.0版本)中對齊后，分析序列堿基組成和變異位點。

1.4.4 單倍型分析 用DNAsp v5軟件對COI序列進行單倍型分析，并計算中華穿山甲的平均核苷酸多樣性(pi)[21]，將中華穿山甲中數(shù)量最多的序列規(guī)定為核心單倍型，其他序列則為稀有單倍型。以正品核心單倍型為標準序列，以稀有單倍型和其之間的相似度為正品的相似度范圍，考察偽品所有單倍型與正品核心單倍型的相似度范圍，確定正品的相似度鑒別指標。

1.4.5 種內(nèi)、種間遺傳距離分析及Barcode gap分析 將所有序列用MEGA軟件進行K2P(Kimura 2-parameter)遺傳距離分析。并利用TAXON DNA/Species identifier軟件計算種內(nèi)及種間遺傳距離的分布頻率，并在Excel中畫出頻率分布直方圖，進行條形碼間隙(barcode gap)分析[22]。

1.4.6 系統(tǒng)發(fā)育樹的聚類分析 在MEGA軟件中用鄰接法(neighbor joining method，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹。系統(tǒng)樹各分支的置信度用自舉檢驗法(bootstrap test)，檢驗各分支的支持率，共進行1000次循環(huán)。

1.4.7 ABGD劃分 ABGD(Automatic barcode gap discovery)基于遺傳距離對樣品進行劃分，劃分在同一組的樣品被認定為是一個種[23]。將樣品對齊的序列在線提交到ABGD網(wǎng)站(http：//wwwabi.snv.jus-sieu.fr/public/abgd/abgdweb.htm)，參數(shù)設(shè)置為：種內(nèi)差異先驗值(prior intraspecific divergence)P為0.001到0.1，最小相對gap寬度值(Minimum relative gap width)X為1.0(K80)。

1.4.8 商品的鑒定 基于穿山甲及其混偽品的COI序列的單倍型信息及物種信息建立比對數(shù)據(jù)庫，穿山甲商品序列可通過DNAMAN軟件與自建穿山甲條形碼數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對，從而確定商品的物種。通過鄰接法與數(shù)據(jù)庫的序列構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹，系統(tǒng)樹各分支的置信度用自舉檢驗法(bootstrap test)，檢驗各分支的支持率，共進行1000次循環(huán)。并用ABGD劃分法對商品序列與數(shù)據(jù)庫序列一起進行劃分，參數(shù)設(shè)置與1.2.7一致。

2 結(jié)果

2.1 DNA條形碼特征

2.1.1 COI序列堿基組成和變異位點 測序結(jié)果拼接且去除引物后得到658 bp的序列，所有序列對齊后長度為600 bp，其中變異位點有232個，堿基T、C、A、G平均含量分別為28.9%、27.6%、26.8%、16.7%。其中A+T含量(55.7%)明顯高于G+C含量(44.3%)，核苷酸堿基構(gòu)成的偏倚是線粒體蛋白質(zhì)編碼基因的一個顯著特征。

2.1.2 單倍型分析 穿山甲及其混偽品的75條600 bp的COI序列，分為了45種單倍型。中華穿山甲不同來源樣品序列有16條，種內(nèi)變異位點有12個，GC含量為0.44～0.45，共獲得6種單倍型(Hap1～Hap6)。中華穿山甲COI基因片段的平均核苷酸多樣性(pi)為0.003 78，單倍型多樣性(Hd)為0.743。COI基因片段中，正品的稀有單倍型與其核心單倍型之間的相似度為98.83%～99.67%，而偽品所有單倍型與正品核心單倍型的相似度為79.50%～95.17%。表4和圖1顯示了中華穿山甲的單倍型類型及核心單倍型的序列。

表4 中華穿山甲單倍型類型

圖1 中華穿山甲核心單倍型(Hap2)序列

2.1.3 種內(nèi)及種間遺傳距離分析 穿山甲及其混偽品的種內(nèi)遺傳距離為0～0.012，種內(nèi)平均遺傳距離為0.003 7，最大值出現(xiàn)在南非穿山甲Manistemminckii。種間遺傳距離值為0.044～0.334，種間差異凈值的最小值出現(xiàn)在馬來穿山甲M.javanica與菲律賓穿山甲M.culionensis之間，為0.044；最大值出現(xiàn)在豬Susscrofadomesticus與黃羊Procapraprzewalskii之間，達到了0.334。種間平均遺傳距離為0.255，遠大于Hebert所推薦的物種鑒定最小種間遺傳距離0.020[24-25]。種間平均遺傳距離約為種內(nèi)平均遺傳距離的69倍，說明COI序列能夠?qū)Υ┥郊准捌浠靷纹愤M行有效的鑒定。

2.1.4 Barcode Gap檢驗 Barcode gap檢驗結(jié)果(見圖2)顯示，穿山甲及其混偽品的種內(nèi)遺傳距離為0%～2%，種間遺傳距離>3%，存在GAP區(qū)，即種內(nèi)遺傳距離最大值<種間遺傳距離最小值，說明穿山甲及其混偽品的COI序列具有較高的種內(nèi)穩(wěn)定性和種間差異性，具有一定的遺傳間隔。

圖2 種內(nèi)和種間遺傳距離的分布

2.1.5 系統(tǒng)發(fā)育樹的聚類分析 由鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)聚類樹(見圖3)可知，中華穿山甲與其他混偽品均單獨聚為一支，支持率均大于95%，各物種可以區(qū)分開。其中，這75條序列分成了2大支系，為穿山甲屬和其他混偽品。穿山甲屬又分成了2個支系：第一個支系為產(chǎn)于亞洲的種類，即馬來穿山甲、菲律賓穿山甲、印度穿山甲、中華穿山甲，這個支系中又分為2個支系，馬來穿山甲與菲律賓穿山甲聚為一支，印度穿山甲與中華穿山甲聚為一支。第二個支系為產(chǎn)于非洲的大穿山甲、南非穿山甲、樹穿山甲、長尾穿山甲，在這個支系中也出現(xiàn)2個分支，大穿山甲、南非穿山甲為一分支，樹穿山甲、長尾穿山甲為另一分支。

2.1.6 基于距離的分類分析 用ABGD對75個樣品進行劃分，結(jié)果包括初始劃分和遞歸劃分2種情況(見圖4)：初始劃分較穩(wěn)定，75個樣品被分成12組。遞歸劃分把75個樣品分成1～31組；P值介于0.01～0.03時，75個樣品被穩(wěn)定地劃分成15個組；這15個分組分別代表了研究的15個物種，與聚類分析結(jié)果呈一一對應(yīng)關(guān)系(見圖3)。

2.2 穿山甲商品的鑒定

35批穿山甲甲片商品COI序列與自建的穿山甲條形碼數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果見表5。在商品序列與自建數(shù)據(jù)庫的序列通過鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)聚類樹中，A114、B103與中華穿山甲聚為一支；A101～A113、A115、A116、A130與印度穿山甲聚為一支；A117～A128、B101、B104與馬來穿山甲聚為一支；A129、B102與大穿山甲聚為一支；A131與樹穿山甲聚為一支。同樣地，ABGD遞歸劃分將35個樣品分別劃分進中華穿山甲組(A114、B103)、馬來穿山甲組(A117～A128、B101、B104)、印度穿山甲組(A101～A113、A115、A116、A130)、大穿山甲組(A129、B102)和樹穿山甲組(A131)。3種方法結(jié)果一致。

圖3 基于COI序列構(gòu)建中華穿山甲及其混偽品的NJ樹及ABGD遞歸劃分結(jié)果

圖4 75個樣品的ABGD劃分結(jié)果

綜合以上結(jié)果可知，35份穿山甲商品中，僅有A114與B103為中華穿山甲(5.7%)，其他樣品均為偽品。其中，以印度穿山甲(45.7%)、馬來穿山甲(40%)為最多。

2.3 印度穿山甲甲片性狀特征

印度穿山甲甲片(見圖5)因生長部位不同，形狀大小也不一致。一般多呈扇面形，長1.8～6.2 cm，寬2.1～6 cm，厚1.76～4.66 mm。甲片外表呈褐色。背面寬端較厚，窄端較薄，中央較厚，邊緣較薄。邊緣圓滑整齊或被磨損，有的有皮肉殘留。背面有多數(shù)縱向排列的線紋及在靠近頂端邊緣的地方會有數(shù)條橫線紋，背面的窄端較光滑，常有零亂與砂石摩擦的痕跡。內(nèi)表面色較淺，中部有一條明顯突起的弓形橫向棱線，其下方有數(shù)條與棱線相平行的細紋，偶有殘留皮脂飛邊或毛，縱向凸起紋理的面向上隆起呈弧形。角質(zhì)質(zhì)地較輕(平均密度為1.57 g·cm-3)，半透明。氣微腥，味淡。

表5 35批穿山甲甲片商品比對結(jié)果

圖5 印度穿山甲甲片

3 討論

成功DNA提取是分子鑒定的基礎(chǔ)。穿山甲甲片及混偽品蹄甲為高度角質(zhì)化的材料，一般方法難以提取DNA。在本研究中，曾嘗試用結(jié)合酶消化的酚-三氯甲烷法提取[24]，耗時近一周；而用DTT結(jié)合試劑盒[26]的方法提取，僅需1 d即可提取成功。前者提取的DNA濃度高于后者，但因后者效率更高且擴增效率也好，最終選擇DTT結(jié)合試劑盒的方法進行提取。在DNA提取之前，甲片及蹄甲應(yīng)用無水乙醇浸泡消毒，再用無菌水浸泡，充分烘干后在紫外燈下照射消毒。在取樣時，需刮去甲片及蹄甲表層，取內(nèi)層，否則容易出現(xiàn)外源DNA的污染的情況，影響測序結(jié)果甚至出現(xiàn)擴增出菌的現(xiàn)象。

本研究利用COI通用引物對穿山甲及其混偽品的DNA進行擴增，均得到了100%的擴增效率與測序效率。采用Kimura-2-parameter模型計算遺傳距離，發(fā)現(xiàn)種間平均遺傳距離為種內(nèi)平均遺傳距離的69倍，滿足種間差異是種內(nèi)差異的10倍的條件，并且種間最小遺傳距離大于種內(nèi)最大遺傳距離。Barcoding gap檢驗表明，穿山甲及其混偽品的COI序列具有一定的遺傳間隔。

從構(gòu)建的NJ樹可以看出，15個物種75份樣品均得到了較好的區(qū)分，各物種形成相對獨立的支。其中，產(chǎn)于亞洲的穿山甲物種和產(chǎn)于非洲的穿山甲物種形成兩個明顯的分支，說明亞洲產(chǎn)穿山甲和非洲產(chǎn)穿山甲有明顯分化，親緣關(guān)系較遠，將其區(qū)分成不同的屬是合適的。亞洲支和非洲支又分別形成兩個分支，即中華穿山甲與印度穿山甲、馬來穿山甲與菲律賓穿山甲、大穿山甲與南非穿山甲、樹穿山甲與長尾穿山甲。在新的分類系統(tǒng)中，穿山甲屬僅包括4種亞洲產(chǎn)穿山甲。其中中華穿山甲與印度穿山甲能爬樹，但主要營地棲生活，有觀點將兩者列為指名亞屬Manis；馬來穿山甲和菲律賓穿山甲均傾向樹棲，后者以前一直作為前者的亞種，2005年才上升為獨立的種；兩者為另一亞屬Paramanis。大穿山甲和南非穿山甲形體大，地棲，幾乎不上樹，在新的分類系統(tǒng)中歸屬于地穿山甲亞屬，或另立地穿山甲屬Smutsia。樹穿山甲和長尾穿山甲則為樹棲，基本不下地，分別代表樹穿山甲亞屬Phataginus和長尾穿山甲亞屬Uromanis，或組成樹穿山甲屬Phataginus[26]。

ABGD法是一種基于barcode gap對序列進行分類的方法，它的優(yōu)點是快速、簡單，即便出現(xiàn)種內(nèi)和種間遺傳距離分布重疊的現(xiàn)象，也可以對數(shù)據(jù)集進行有效的劃分[23]。在本研究中將ABGD法作為對數(shù)據(jù)分類的一種補充方法，與聚類分析結(jié)合，可為分類結(jié)果的正確性提供支持，使得研究更加完善。用ABGD法進行劃分，初始劃分只能對80%(12/15)的物種進行解析。在遞歸劃分中，P值介于0.01～0.03時，為較可靠的分組[22]；本研究中，15個物種在P值為0.01～0.03時，得到了穩(wěn)定的劃分，結(jié)果與形態(tài)鑒定結(jié)果、聚類分析結(jié)果呈對應(yīng)關(guān)系。

綜合以上結(jié)果可知，基于COI序列的DNA條形碼是穿山甲屬物種鑒定的有效手段，能夠為穿山甲的快速鑒定提供可靠依據(jù)。

近年來已有穿山甲COI條形碼研究的報道[14-17]。本研究中，除增加了大穿山甲實體樣本外，更為重要的是建立的數(shù)據(jù)庫中包含了目前全球穿山甲屬物種所有的COI單倍型序列。另外，采取了序列相似性分析、系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建和ABGD遞歸劃分3種方法進行綜合鑒定。全面的數(shù)據(jù)庫和綜合鑒定手段，提高了穿山甲的鑒定效率和準確性。

應(yīng)用DNA條形碼的方法在穿山甲商品的鑒定中發(fā)現(xiàn)正品穿山甲甚少，主流商品為馬來穿山甲和印度穿山甲。印度穿山甲以前較少報道，目前市場上逐漸增多。我們對印度穿山甲的性狀特征進行了詳細描述，發(fā)現(xiàn)其與中華穿山甲、馬來穿山甲在形態(tài)上極為相似(樹穿山甲和大穿山甲有比較明確的性狀鑒別特征[6])。我們又對3種穿山甲甲片密度進行了測定，發(fā)現(xiàn)馬來穿山甲、印度穿山甲、中華穿山甲的平均密度分別為1.49、1.57、1.60 g·cm-3；馬來穿山甲質(zhì)地較輕，而印度穿山甲與中華穿山甲的質(zhì)地接近。雖然三者從性狀上難以區(qū)分，但用DNA條形碼可準確鑒定其基原。

基于COI序列的DNA條形碼鑒別方法，可從分子水平實現(xiàn)對穿山甲的有效鑒定，為穿山甲的市場監(jiān)管、打擊非法貿(mào)易及保護穿山甲資源提供技術(shù)支持，具有重要的實用價值。目前，這種方法在市售鹿茸粉、僵蠶、海馬等藥材中也取得了成功，說明DNA條形碼技術(shù)在動物藥商品鑒定中是行之有效的，值得推廣應(yīng)用[27-29]。