煙草懸浮細(xì)胞在鎘脅迫下微絲形態(tài)與黏彈性變化的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)

劉藝璇，周鐵安,2，蘭雅琴，潘煒?biāo)?2,*

1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128 2. 湖南省細(xì)胞力學(xué)與功能分析工程技術(shù)研究中心，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)沙410128

近年來(lái)隨著我國(guó)工業(yè)化、城鎮(zhèn)化的快速推進(jìn)，以及大量化肥和農(nóng)藥的使用，加之污水灌溉、固體垃圾堆積及礦山開(kāi)采冶煉等多種原因，導(dǎo)致重金屬特別是鎘污染日趨嚴(yán)重。鎘(cadmium, Cd)是環(huán)境中常見(jiàn)的重金屬元素，卻并非植物生長(zhǎng)發(fā)育所需的必需元素。相反，當(dāng)鎘累積到一定濃度時(shí)，植物的生長(zhǎng)發(fā)育與生理活動(dòng)會(huì)受到不同程度的影響。鎘對(duì)植物毒害的表現(xiàn)形式多種多樣[1]，游離鎘毒害使植物細(xì)胞骨架組裝紊亂[2]，超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)異常[3]，葉綠體膜系統(tǒng)崩潰及類(lèi)囊體結(jié)構(gòu)退化[4]，組織完整性受損直至植株死亡[5]。水體中的鎘污染可導(dǎo)致水生植物氮代謝紊亂、氮素積累量下降[6]；游離鎘可推動(dòng)水體中藻類(lèi)群落演替[7]，使水體中浮游植物多樣性下降[8]。環(huán)境中的鎘還在水稻等植物中富集[9]，通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，嚴(yán)重影響人類(lèi)健康[10]。吸收入植物體內(nèi)游離鎘，易與酶活性中心或蛋白質(zhì)中的巰基結(jié)合，取代原本位于活性中心的其他二價(jià)金屬離子，使酶失去原有功能而失活變性，含有Zn、Mg和Fe的酶及光合磷酸化和呼吸電子傳遞鏈等生理活動(dòng)都將受到抑制和破壞[11]。

植物的鎘逆境脅迫響應(yīng)是多個(gè)代謝酶系統(tǒng)共同參與的整體調(diào)控反應(yīng)[12]。鎘脅迫影響植物內(nèi)生激素平衡，光合能力受損[13]；鎘脅迫煙草各項(xiàng)激素與膜質(zhì)過(guò)氧化系統(tǒng)呈現(xiàn)低濃度下合成上升而高濃度時(shí)下降的特征[14]；過(guò)氧化酶系統(tǒng)對(duì)清除鎘毒害產(chǎn)生的活性氧具有重要作用[15]；植株整體可借助自身結(jié)構(gòu)將所吸收的鎘鈍化并轉(zhuǎn)移，減少外環(huán)境中鎘毒害影響[16]；小麥根系在鎘脅迫下會(huì)改變氨基酸分泌物以減輕鎘危害[17]。植物防御素類(lèi)似物蛋白調(diào)控基因CAL1可指導(dǎo)重金屬螯合物的合成，借此定向調(diào)控鎘在植株體中的積累過(guò)程[18]。細(xì)胞自噬過(guò)程中可能通過(guò)調(diào)節(jié)活性氧應(yīng)答鎘脅迫[19]。植物的不同器官對(duì)鎘耐受程度有所區(qū)別，鎘在水稻不同部位累積為根>莖葉鞘>葉片[20]。鎘脅迫可能通過(guò)影響微管蛋白組裝而擾亂正常的染色體聚合與分配過(guò)程，并引發(fā)染色體畸變[21]。徐萍[22]發(fā)現(xiàn)在10-5mol·L-1鎘濃度下大蒜(AlliumsativumL.)根尖分裂間期微管會(huì)出現(xiàn)異常條紋、斷片和碎片化；分裂期微管會(huì)出現(xiàn)異常的微管凝結(jié)現(xiàn)象。目前對(duì)于植物吸收鎘機(jī)理的生物學(xué)研究大多集中在模式植物和常見(jiàn)農(nóng)作物，對(duì)植物懸浮細(xì)胞在重金屬脅迫下力學(xué)參數(shù)變化的研究目前報(bào)道較少，我們對(duì)砷脅迫[23]和鎘脅迫下植物懸浮細(xì)胞的整體黏彈性與應(yīng)力變化進(jìn)行了初步的探索。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 供試材料

Lifeact-EGFP煙草懸浮細(xì)胞：自行構(gòu)建的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白標(biāo)記微絲[24](Lifeact-EGFP)的轉(zhuǎn)基因本氏煙草(Nicotianabenthamiana)(以下簡(jiǎn)稱(chēng)Lifeact-EGFP煙草)。在含有100 mg·L-1潮霉素(上海生工)的1/2 MS培養(yǎng)基平板上播種Lifeact-EGFP煙草，待種子萌芽未出真葉時(shí)，將萌芽轉(zhuǎn)移到BY-2培養(yǎng)基平板(MS+3.0 mg·L-12,4-D+1.0 mg·L-16-BA+30 g·L-1Sucrose+15 g·L-1Agar)上誘導(dǎo)愈傷組織，愈傷組織長(zhǎng)出后再傳代3～4次，挑取色澤淡黃、質(zhì)地松散的愈傷組織轉(zhuǎn)入BY-2細(xì)胞液體培養(yǎng)基(MS+3.0 mg·L-12,4-D+1.0 mg·L-16-BA+30 g·L-1Sucrose)中擴(kuò)增，每2周繼代一次，繼代時(shí)取少量細(xì)胞懸浮液鏡檢，直至得到離散程度較高的煙草懸浮細(xì)胞。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鎘脅迫下煙草細(xì)胞微絲組裝程度變化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)

配制含鎘BY-2液體培養(yǎng)基：將CdCl2·2.5H2O晶體(國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司，分析純)溶解于BY-2液體培養(yǎng)基中，配制10-2mol·L-1培養(yǎng)基母液，梯度稀釋至10-8mol·L-1。

靜電黏附界面修飾：與動(dòng)物上皮細(xì)胞不同，植物懸浮細(xì)胞不具備貼壁效應(yīng)，需要一個(gè)被修飾的界面使之形成基本同一的單層，以備后續(xù)觀察及監(jiān)測(cè)。聚二烯丙基二甲基氯化銨(poly dimethyl diallyl ammonium chloride, PDADMAC)是一種高分子強(qiáng)陽(yáng)性電解質(zhì)，工業(yè)生產(chǎn)中常用于捕捉帶負(fù)電的物質(zhì)，此處用于植物細(xì)胞的靜電黏附修飾[25]。ITO小池為實(shí)驗(yàn)室自制，底部為氧化銦錫(indium tin oxide, ITO)鍍層玻片(珠海凱為光電股份有限公司)，小池最大容量1 000 μL，實(shí)驗(yàn)中所用最大容量為500 μL。將ITO小池置于超凈臺(tái)內(nèi)，紫外線照射滅菌不少于30 min。向ITO小池中加入200 μL經(jīng)過(guò)濾滅菌的1%(V∶V)PDADMAC(Sigma-Aldrich，德國(guó))溶液，遮光修飾不少于30 min，然后吸去多余的1% PDADMAC溶液，在超凈工作臺(tái)內(nèi)以超純氮?dú)?長(zhǎng)沙鑫湘氣體分析儀器經(jīng)營(yíng)部)吹干，使ITO表面形成一層靜電修飾膜。完成后以小塊封板膜密封池口保持內(nèi)部潔凈無(wú)菌。

在ITO玻底小池中黏附細(xì)胞：將Lifeact-EGFP煙草懸浮細(xì)胞過(guò)篩，提取100～500目之間即短軸徑在25～165 μm的懸浮細(xì)胞為待黏附的細(xì)胞，適當(dāng)調(diào)整細(xì)胞濃度至每毫升500～1 000個(gè)。吸取過(guò)篩后細(xì)胞懸液500 μL加入到已修飾的ITO小池內(nèi)，小塊透明封板膜密封池口，靜置遮光黏附約30 min，使懸浮細(xì)胞被靜電吸引至ITO鍍層表面。

脅迫實(shí)時(shí)觀察：將黏附細(xì)胞的ITO小池置于LumascopeTM720全自動(dòng)活細(xì)胞成像系統(tǒng)(Etaluma，美國(guó))的載物臺(tái)上，觀察細(xì)胞黏附情況，選取熒光信號(hào)鮮明、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Lifeact-EGFP煙草懸浮細(xì)胞視野。從小池中替換實(shí)驗(yàn)組濃度的含鎘培養(yǎng)基250 μL，使小池中鎘離子濃度為所加入的含鎘培養(yǎng)基的1/2。迅速開(kāi)啟延時(shí)拍攝程序，設(shè)置總時(shí)長(zhǎng)5 h，間隔時(shí)長(zhǎng)1 min。進(jìn)行空白對(duì)照實(shí)時(shí)觀察時(shí)，沿用上述操作，將加入的含鎘培養(yǎng)基更換為無(wú)鎘的BY-2液體培養(yǎng)基。

基于圖像的熒光半定量分析：選取最具代表性的樣本，將脅迫實(shí)時(shí)觀察采集的圖像導(dǎo)入軟件ImageJ中。Image → Color → Split Channels將三色場(chǎng)分離，選取綠場(chǎng)灰度圖像；Image → Adjust → Threshold選擇Default計(jì)量模式，勾選Dark background識(shí)別暗底背景，設(shè)置量程為40～255；Analyze → Set Measurement，勾選Area、Mean gray value、Standard deviation、Limit to threshold這4項(xiàng)；最后Analyze → Measure，測(cè)得該綠場(chǎng)圖像整體的平均灰度強(qiáng)度值(mean gray value, Mean)與熒光區(qū)域面積值(Area)，并以公式：熒光強(qiáng)度總和(integrated density, IntDen) = 平均熒光強(qiáng)度(Mean)×熒光區(qū)域面積(Area)求得圖像的總體熒光強(qiáng)度值。每一脅迫觀察取樣31張，即每10 min一幀，取樣時(shí)長(zhǎng)5 h。數(shù)據(jù)處理：使用Origin2018制作基于圖像的熒光半定量數(shù)據(jù)變化圖。

1.2.2 在QCM-922A多通道石英晶體微天平上實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)鎘脅迫下煙草細(xì)胞黏彈性變化

該法所用Teflon?模塊池為實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)，由Teflon?塊經(jīng)機(jī)床切削制造，規(guī)格適配所用ITO鍍層9 MHz AT切石英晶體傳感器芯片 (仁路晶體) (以下簡(jiǎn)稱(chēng)傳感器芯片)。完成組裝的傳感器芯片-Teflon測(cè)試池，設(shè)計(jì)最大容量250 μL，實(shí)驗(yàn)所用最大容量200 μL。測(cè)試池清潔消毒、黏附界面修飾方法同1.2.1。連通測(cè)試模塊與QCM-922A多通道石英晶體微天平(AMETEK Scientific Instruments Ltd.，美國(guó))，在QCM調(diào)制界面上調(diào)整所測(cè)傳感器芯片相關(guān)參數(shù)，設(shè)置采樣時(shí)間為1 s，從空池開(kāi)始實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。待所示曲線平穩(wěn)后，向測(cè)試池加液口中加入BY-2液體培養(yǎng)基200 μL，繼續(xù)運(yùn)行不少于6～8 h，觀察所顯示的圖形；運(yùn)行至平穩(wěn)后，從池中替換100 μL細(xì)胞懸浮液，即向測(cè)試池中加入細(xì)胞3 000～5 000個(gè)；繼續(xù)運(yùn)行4～6 h，使懸浮細(xì)胞完全黏附在傳感器芯片表面；待運(yùn)行至平穩(wěn)，從小池中替換實(shí)驗(yàn)組濃度的含鎘培養(yǎng)基100 μL，使小池中鎘離子濃度為所加入的含鎘培養(yǎng)基的一半，繼續(xù)運(yùn)行不少于5 h，停機(jī)并保存數(shù)據(jù)。進(jìn)行空白對(duì)照組細(xì)胞黏彈性監(jiān)測(cè)時(shí)，沿用上述操作，將替換的含鎘培養(yǎng)基變更為無(wú)鎘的BY-2液體培養(yǎng)基。

收集在石英晶體微天平上所測(cè)定數(shù)據(jù)，以公式CVI=ΔR/ΔF計(jì)算細(xì)胞黏彈性指數(shù)。式中：CVI即細(xì)胞黏彈性指數(shù)(cell viscoelastic index)[26]，ΔR為扣除基礎(chǔ)的電阻變化值，ΔF為扣除基礎(chǔ)的頻率變化值。完成計(jì)算后，在Origin2018上繪制CVI隨時(shí)間變化圖。

1.2.3 鎘脅迫下5 h內(nèi)煙草懸浮細(xì)胞過(guò)氧化氫酶(CAT)活力測(cè)定

準(zhǔn)備樣品：將煙草懸浮細(xì)胞經(jīng)100目過(guò)篩，抽樣以血球計(jì)數(shù)板法計(jì)數(shù)并估算細(xì)胞濃度。將過(guò)篩的懸浮細(xì)胞等體積分裝至10 mL小離心管中，每管6 mL。

脅迫處理：1 000 r·min-1離心10 min使細(xì)胞沉淀在底部，將管中一半體積(3 mL)的培養(yǎng)基上清替換為含鎘離子BY-2液體培養(yǎng)基，使管中鎘離子濃度為所加入的含鎘培養(yǎng)基的一半，重懸細(xì)胞并開(kāi)始計(jì)時(shí)；在開(kāi)始計(jì)時(shí)后第1、2、3、4和5小時(shí)以去尖移液器吸取細(xì)胞懸浮液1 mL轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，4 000 r·min-1離心棄去含鎘培養(yǎng)基后，等體積pH 7.4的PBS(北京索萊寶科技有限公司)溶液重懸細(xì)胞，迅速浸入液氮中速凍10 min。

測(cè)試取樣：將速凍的樣品在4 ℃環(huán)境中解凍后搖勻，3 000 r·min-1離心15 min，取上清為樣品，按過(guò)氧化酶微量樣品試劑盒(南京建成生物工程研究所)說(shuō)明書(shū)操作制樣，用酶標(biāo)儀(Multiskan skyhigh全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技有限公司)測(cè)定。

數(shù)值統(tǒng)計(jì)：計(jì)算酶活力時(shí)，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)所述原理公式，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需將組織濃度改為細(xì)胞濃度，定義酶活力單位為單位時(shí)間內(nèi)每個(gè)細(xì)胞分解相應(yīng)底物量(U·cell-1)，公式如下：

每樣本重復(fù)3次以校正偏差，完成計(jì)算后在Origin2018上繪制酶活力隨時(shí)間變化圖。

2 結(jié)果(Results)

2.1 鎘脅迫下煙草細(xì)胞微絲組裝程度變化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)

如圖1和圖4所示，Lifeact-EGFP煙草懸浮細(xì)胞在10-4～10-7mol·L-1鎘離子脅迫下，細(xì)胞具有的平均熒光強(qiáng)度、熒光區(qū)域面積與熒光強(qiáng)度總和均在脅迫觀察早期就開(kāi)始下降；熒光信號(hào)的上述3個(gè)參數(shù)在10-4mol·L-1組別下降最快；在10-4～10-6mol·L-1組別，脅迫處理所用鎘離子濃度越大，細(xì)胞熒光信號(hào)下降的速度越快；在10-7mol·L-1組別，細(xì)胞熒光信號(hào)在脅迫開(kāi)始早期下降得很快，但在后期下降速度很慢，并且直到觀察結(jié)束時(shí)，細(xì)胞內(nèi)還有殘余的熒光信號(hào)。在10-8mol·L-1組別中，細(xì)胞具有的平均熒光強(qiáng)度、熒光區(qū)域面積與熒光強(qiáng)度總和在脅迫觀察早期呈現(xiàn)上升，熒光強(qiáng)度總和高于脅迫觀察開(kāi)始時(shí)的值，并在高于初始值的范圍內(nèi)保持近1 h，而后緩慢下降(圖2和圖4(e))。Lifeact-EGFP煙草懸浮細(xì)胞在無(wú)鎘離子脅迫時(shí)，微絲熒光強(qiáng)度緩慢下降(圖3和圖4(f))。

圖1 Lifeact-EGFP煙草懸浮細(xì)胞在10-4～10-7 mol·L-1鎘離子脅迫下的熒光實(shí)時(shí)觀察圖像注: (a) 10-4 mol·L-1，(b) 10-5 mol·L-1，(c) 10-6 mol·L-1，(d) 10-7 mol·L-1；從左至右分別為0 s、10 min、1 h和2 h時(shí)的細(xì)胞熒光強(qiáng)度實(shí)時(shí)變化，標(biāo)尺為100 μm。Fig. 1 Real-time fluorescence images of Lifeact-EGFP tobacco suspension cells observed under the stress of 10-4～10-7 mol·L-1 cadmium ionNote: (a) 10-4 mol·L-1, (b) 10-5 mol·L-1, (c) 10-6 mol·L-1, (d) 10-7 mol·L-1; from left to right are the real-time changes of cells’ fluorescence intensity at 0 s, 10 min, 1 h and 2 h; bar is 100 μm.

圖2 Lifeact-EGFP煙草懸浮細(xì)胞在10-8 mol·L-1鎘離子脅迫下不同時(shí)間的熒光實(shí)時(shí)觀察圖像注：標(biāo)尺為100 μm。Fig. 2 Real-time fluorescence images of Lifeact-EGFP tobacco suspension cells observed under the stress of 10-8 mol·L-1 cadmium ion at different timeNote: Bar is 100 μm.

圖3 Lifeact-EGFP煙草懸浮細(xì)胞在無(wú)鎘離子脅迫下不同時(shí)間的熒光實(shí)時(shí)觀察圖像注：標(biāo)尺為100 μm。Fig. 3 Real-time fluorescence images of Lifeact-EGFP tobacco suspension cells in the absence of cadmium ion (blank control) at different timeNote: Bar is 100 μm.

圖4 Lifeact-EGFP煙草懸浮細(xì)胞在不同濃度鎘離子脅迫下0～5 h的熒光強(qiáng)度總和(IntDen)實(shí)時(shí)變化注：(a) 10-4 mol·L-1；(b) 10-5 mol·L-1；(c) 10-6 mol·L-1；(d) 10-7 mol·L-1；(e) 10-8 mol·L-1；(f) 空白對(duì)照。Fig. 4 Real-time changes of the total fluorescence intensity (IntDen) of Lifeact-EGFP tobacco suspension cells under the stress of different concentrations of cadmium ion for 0～5 hNote: (a) 10-4 mol·L-1; (b) 10-5 mol·L-1; (c) 10-6 mol·L-1; (d) 10-7 mol·L-1; (e) 10-8 mol·L-1; (f) blank control.

2.2 QCM-922A多通道石英晶體微天平上實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)鎘脅迫下煙草細(xì)胞黏彈性變化

PDADMAC靜電修飾方法將煙草懸浮細(xì)胞黏附在傳感器芯片表面，通過(guò)QCM技術(shù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)不同濃度鎘離子脅迫下煙草懸浮細(xì)胞的黏彈性變化。結(jié)果顯示，煙草懸浮細(xì)胞在10-4～10-7mol·L-1鎘離子濃度范圍脅迫下，細(xì)胞黏彈性在監(jiān)測(cè)時(shí)間內(nèi)呈現(xiàn)早期短暫上升，總體趨勢(shì)下降的變化(圖5(a)～(d))；在10-8mol·L-1鎘離子脅迫下，細(xì)胞黏彈性在監(jiān)測(cè)時(shí)間內(nèi)呈現(xiàn)先降后升的變化(圖5(e))；在無(wú)鎘離子的空白對(duì)照中，在更換培養(yǎng)基早期細(xì)胞黏彈性下降，后期保持不變(圖5(f))。

圖5 煙草懸浮細(xì)胞在不同濃度鎘離子脅迫下5 h內(nèi)細(xì)胞黏彈性指數(shù)(CVI)變化注：(a)10-4 mol·L-1；(b)10-5 mol·L-1；(c)10-6 mol·L-1；(d)10-7 mol·L-1；(e)10-8 mol·L-1；(f)空白對(duì)照。Fig. 5 Changes of cell viscoelasticity index (CVI) of tobacco suspension cells under the stress of different concentrations of cadmium ion within 5 hNote: (a) 10-4 mol·L-1; (b) 10-5 mol·L-1; (c) 10-6 mol·L-1; (d) 10-7 mol·L-1; (e) 10-8 mol·L-1; (f) blank control.

2.3 鎘脅迫下5 h內(nèi)煙草懸浮細(xì)胞過(guò)氧化氫酶活力測(cè)定

如圖6所示，所有實(shí)驗(yàn)組別CAT酶活力均高于空白對(duì)照，并呈現(xiàn)出先升后降的整體變化趨勢(shì)。其中10-8mol·L-1組別的酶活力波動(dòng)程度最小。

圖6 過(guò)氧化氫酶(CAT)在不同濃度梯度鎘離子脅迫下5 h內(nèi)酶活力變化Fig. 6 Catalase (CAT) activity changes within 5 h under different concentration gradient of cadmium ion stress

3 討論(Discussion)

懸浮細(xì)胞本身具有分化程度低、代謝較旺盛、與相鄰細(xì)胞粘連程度低等特點(diǎn)，這使得我們能夠從細(xì)胞層次探索鎘逆境脅迫過(guò)程中植物細(xì)胞生理效應(yīng)的變化。通過(guò)綠色熒光蛋白標(biāo)記細(xì)胞微絲，本研究首先監(jiān)測(cè)了不同濃度鎘離子脅迫下細(xì)胞微絲形態(tài)的變化。采用本課題組建立的植物細(xì)胞力學(xué)方法[23, 25-26]，本研究探索了鎘逆境脅迫對(duì)煙草懸浮細(xì)胞黏彈性指數(shù)的影響。我們認(rèn)為鎘脅迫下植物細(xì)胞黏彈性變化的主要影響因素包括細(xì)胞壁的侵蝕與交聯(lián)程度變化、細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)的崩解、細(xì)胞骨架的聚合和解聚等3個(gè)方面。

細(xì)胞壁是重金屬離子跨膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的第一道屏障結(jié)構(gòu)。一方面，細(xì)胞壁對(duì)重金屬離子的固定、吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程起著重要的作用。另一方面，環(huán)境中的鎘離子在細(xì)胞壁兩側(cè)化學(xué)勢(shì)差的推動(dòng)下，可從外至內(nèi)逐漸侵蝕破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)[27]，使細(xì)胞壁逐漸解體。細(xì)胞壁外側(cè)受侵蝕同時(shí)，胞內(nèi)過(guò)氧化物累積促使酚類(lèi)化合物和糖蛋白作用促進(jìn)細(xì)胞壁交聯(lián)[28]；而在后期過(guò)氧化物積累形成的羥自由基[29]將切割細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中糖鍵，促進(jìn)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的解體。目前由于實(shí)驗(yàn)條件的限制，本研究無(wú)法區(qū)分細(xì)胞壁黏彈性與細(xì)胞膜黏彈性變化。本文也從細(xì)胞力學(xué)角度首次發(fā)現(xiàn)了在10-4～10-7mol·L-1鎘離子濃度范圍脅迫下，細(xì)胞黏彈性短暫上升(細(xì)胞變硬)的現(xiàn)象。

在鎘侵蝕細(xì)胞壁同時(shí)，極少量的鎘離子通過(guò)細(xì)胞膜上鈣離子通道[30]進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，擾亂細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)蛋白信號(hào)通路調(diào)控[31]的一系列原有生理活動(dòng)，細(xì)胞內(nèi)生理反應(yīng)活動(dòng)失控。游離鎘可誘發(fā)細(xì)胞膜電位去極化與超極化[32]。細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)將從線粒體等高代謝率部位開(kāi)始大量累積膜質(zhì)過(guò)氧化物等自由基[33]，伴隨著細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)系統(tǒng)上膜脂過(guò)氧化物的大量累積[34]，原有生物膜磷脂雙分子結(jié)構(gòu)破壞并擴(kuò)散為整個(gè)細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的解體[35]。細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)的崩解是本研究監(jiān)測(cè)到的CVI后續(xù)降低(細(xì)胞變軟)重要影響因素。

鎘逆境脅迫對(duì)細(xì)胞內(nèi)微絲骨架的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)的影響呈現(xiàn)多態(tài)性。本研究觀測(cè)到了微絲骨架在鎘脅迫下普遍的解聚和在極低濃度鎘離子(10-8mol·L-1)脅迫下的早期聚合現(xiàn)象(圖1和圖2)。一種可能的解釋是極微量的胞內(nèi)游離二價(jià)鎘取代原有鈣調(diào)蛋白介導(dǎo)信號(hào)通路，不可逆地促進(jìn)肌動(dòng)蛋白單體合成[36]。然而在本文所涉整個(gè)鎘逆境脅迫中，細(xì)胞內(nèi)促進(jìn)肌動(dòng)蛋白合成與微絲組裝的因素，其效力遠(yuǎn)低于破壞細(xì)胞肌動(dòng)蛋白合成與微絲組裝的各種因素。在鎘離子脅迫下，胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白單體結(jié)構(gòu)異常及變性[37]；細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)塌陷解體使與膜結(jié)構(gòu)相連的微絲結(jié)構(gòu)與膜系統(tǒng)一同解體[38]，表現(xiàn)為所觀測(cè)到的微絲標(biāo)記熒光信號(hào)的不斷下降(圖1和圖4)。

本文從細(xì)胞力學(xué)角度為植物重金屬逆境脅迫生理生化的研究提供了新的視角。目前對(duì)植物細(xì)胞黏彈性監(jiān)測(cè)的研究方法尚不完備，無(wú)法全面地解釋鎘逆境下植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分的詳細(xì)動(dòng)態(tài)響應(yīng)過(guò)程與生物力學(xué)參數(shù)變化，如需詳細(xì)探索重金屬脅迫對(duì)植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響機(jī)制，尚待細(xì)胞力敏傳感技術(shù)、高分辨率成像工具與細(xì)胞內(nèi)示蹤技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展。