二甲亞砜對心臟毒性作用的機(jī)制研究*

邱全友，張 娟，范新榮，何容芳，高小麗，范澤楠，李妙齡△

(1.內(nèi)江市中醫(yī)醫(yī)院麻醉科，四川內(nèi)江 641000；2.醫(yī)學(xué)電生理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/四川省心血管預(yù)防和治療協(xié)同創(chuàng)新中心/西南醫(yī)科大學(xué)心血管研究所，四川瀘州 646000；3.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，四川瀘州 646000)

二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)是一種高極性的雙親性分子，是應(yīng)用最廣泛和最有效的化學(xué)溶劑或載體，被稱為“萬能溶劑”。DMSO還廣泛作為滲透性保護(hù)劑，能降低細(xì)胞冰點(diǎn)，減少冰晶的形成，減少自由基對細(xì)胞的損傷，改變生物膜對電解質(zhì)、藥物和代謝產(chǎn)物的通透性。另外，DMSO對心血管和神經(jīng)系統(tǒng)還具有一定的治療作用，有研究報道在冠狀動脈左前降支結(jié)扎導(dǎo)致的心肌缺血大鼠模型上，低劑量的DMSO可降低血管阻力和增加心排血量[1]。而在作為廣譜溶劑時，其不良反應(yīng)常被忽略。早在1995年OGURA等[2]研究發(fā)現(xiàn)，DMSO濃度依賴性地延長豚鼠乳頭肌動作電位時程，降低動作電位0期最大上升速度(Vmax)。也有研究顯示，眼內(nèi)注射5 μL濃度大于1%的DMSO可明顯導(dǎo)致大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)生凋亡，且呈劑量依賴性[3]。在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞株細(xì)胞上也同樣發(fā)現(xiàn)DMSO濃度在2%(w/v)及以上可濃度依賴性地降低細(xì)胞的存活率，其半數(shù)抑制濃度為2.14%(w/v)。另有研究也證實(shí)，實(shí)驗(yàn)室常用的DMSO可在體內(nèi)低溫條件下間接增加Tau蛋白的磷酸化或直接在體外明顯增加Tau蛋白的磷酸化[4]。DMSO作為一種溶劑，通常還被用作骨髓和器官移植的冷凍保護(hù)劑。HANSLICK等[5]研究發(fā)現(xiàn)，DMSO可導(dǎo)致不同年齡的小鼠大腦神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡。在體外大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)條件下，0.5%和1.0%的DMSO可導(dǎo)致神經(jīng)元的減少，這表明DMSO可導(dǎo)致細(xì)胞毒作用。DMSO在神經(jīng)系統(tǒng)具有一定的毒性，但在心血管系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)研究中需經(jīng)常應(yīng)用DMSO作為藥物的溶劑，因此，針對心臟及心肌細(xì)胞，明確其最小的安全濃度具有重要的意義。因此，本研究以新生大鼠的心肌細(xì)胞和離體灌流的豚鼠心臟為研究對象，探究不同濃度的DMSO對心肌活力和心臟功能的影響，尋找DMSO溶劑的安全有效的濃度范圍，為心血管疾病的基礎(chǔ)與臨床研究提供有效的保障。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 無特殊病原體(SPF)級健康成年豚鼠12只，體質(zhì)量250～300 g；乳大鼠(出生1～3 d)25只，購于西南醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。

1.1.2主要試劑 DMSO購于美國Sigma公司，CCK8試劑盒購于碧云天試劑公司。

1.2方法

1.2.1不同濃度DMSO對心肌細(xì)胞存活率的測定 新生1～3 d的乳大鼠25只分5次進(jìn)行培養(yǎng)。新生大鼠置于75%乙醇中消毒，仰臥位固定，開胸迅速取出心臟，將心臟剪成3～4塊后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗心肌組織內(nèi)的淤血2～3次，再將心肌組織置于0.25%胰酶中4 ℃過夜；將過夜后的心肌組織用PBS清洗后置于37 ℃恒溫的酶液(Ⅱ型膠原酶1 mg/mL+牛血清清蛋白5 mg/mL)中消化約15 min，離心后接種于10 cm培養(yǎng)盤于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h，此時成纖維細(xì)胞已貼壁，再將心肌細(xì)胞懸液接種于96孔板內(nèi)培養(yǎng)24 h，每個處理因素設(shè)4個復(fù)孔。DMSO按體積比0(對照)、0.03%、0.30%、1.00%、3.00%、10.00%加入，再培養(yǎng)24 h后終止培養(yǎng)，每孔加入10 μL CCK-8，37 ℃孵育2 h，用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測每孔的吸光度值(A值)，每組4孔取平均值，按公式計算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)，每組重復(fù)5次。

1.2.2Langendorff灌流豚鼠心臟檢測DMSO對心率、心電圖和室內(nèi)壓的影響 豚鼠雌雄不限，肝素1 000 IU/kg腹腔注射20 min后，用1%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉后快速取出心臟，分離主動脈后迅速將主動脈固定于Langendorff灌流裝置上(注意插管不宜過深，0.5～1.0 cm)，再用氧飽和的含鈣(CaCl21.8 mmol/L)臺式液恒流、恒溫(37 ℃)灌流心臟，整個灌流過程中盡量不要有氣泡，灌流20～30 min待心臟灌流液清亮，心臟收縮平穩(wěn)后于左心耳根部剪一小切口將制備好的球囊經(jīng)左心房、房室瓣固定于左心室內(nèi)，球囊遠(yuǎn)端與AD instruments電生理儀相連的壓力傳感器相連。通過連接于三通管上的注射器向心室內(nèi)球囊緩慢注射適量的臺式液，以調(diào)整左心室的舒張末期壓力，且灌流速度控制在6 mL/min左右。左心室球囊固定好后，于心尖處和主動脈根部分別固定心電記錄電極的正負(fù)極，電極遠(yuǎn)端連于電生理儀的心電導(dǎo)聯(lián)接口，通過電生理記錄軟件同步記錄不同濃度DMSO[0(對照)、0.03%、0.10%、0.30%、1.00%、3.00%、10.00%，每個濃度給藥時間為10 min]對豚鼠心室內(nèi)壓、心電圖和心率的影響。通過AD instruments電生理記錄軟件分析DMSO對左心室發(fā)展壓(LVDP，LVDP=左心室收縮壓-左心室舒張壓)、左心室內(nèi)壓最大上升速率(dp/dtmax)和左心室內(nèi)壓最大下降速率(dp/dtmin)的影響。通過記錄的心電圖分析心率、PR段、QRS波、QTc和ST段的變化。

2 結(jié) 果

2.1DMSO對乳鼠心肌細(xì)胞活性的影響 乳大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，給予不同濃度DMSO(0、0.03%、0.10%、0.30%、1.00%、3.00%、10.00%)培養(yǎng)24 h后，鏡下可觀察到隨著DMSO濃度的增加心肌細(xì)胞的數(shù)量逐漸減少，見圖1A。CCK-8結(jié)果顯示3.00%、10.00%的DMSO均明顯減少心肌細(xì)胞的存活率，見圖1B。

2.2DMSO對Langendorff灌流豚鼠心率和心電圖的影響 Langendoff灌流豚鼠心臟上固定好檢測室內(nèi)壓的球囊和心電檢測電極后，待室內(nèi)壓力穩(wěn)定，可同步記錄室內(nèi)壓、心率和心電圖。給予不同濃度的DMSO(0、0.03%、0.10%、0.30%、1.00%、3.00%、10.00%，每個濃度按6 mL/min速度持續(xù)給藥10 min，n=12)，給藥過程持續(xù)記錄。結(jié)果顯示，DMSO濃度依賴性地抑制心率，對照組的心率為(215.23±5.34)次/分鐘，0.30% DMSO作用后的心率為(214.42±3.16)次/分鐘；3.00% DMSO作用后的心率為(204.67±3.75)次/分鐘，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而10.00% DMSO作用后的心率降至(191.41±2.98)次/分鐘，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

心電圖分析結(jié)果顯示，不同濃度的DMSO對QRS波寬和QTc間期沒有明顯的作用。10.00% DMSO可導(dǎo)致ST段形態(tài)的改變，ST段的抬高或壓低；10.00% DMSO還可導(dǎo)致ST段明顯延長，與對照組相比，ST段時長由(0.44±0.13)ms增加到(0.90±0.21)ms(n=12，P<0.01)。10.00% DMSO還可使T波形態(tài)發(fā)生明顯的改變，由原來的鈍圓形變?yōu)楦呒獾腡波，見圖3。

A：不同濃度DMSO作用24 h后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；B：不同濃度DMSO處理細(xì)胞24 h后CCK-8檢測的細(xì)胞存活率；*：P<0.05，**：P<0.01，與對照組比較;1:對照組;2:DMSO 0.03%;3:DMSO 0.10%;4:DMSO 0.30%;5:DMSO 1.00%;6:DMSO 3.00%;7:DMSO 10.00%

圖1不同濃度的DMSO對心肌存活率的影響(n=5)

2.3DMSO對Langendorff灌流豚鼠心臟功能的影響 Langendorff恒流恒溫灌流豚鼠心臟后，固定好心電電極和左心室內(nèi)球囊電極，待心室內(nèi)壓力和心電穩(wěn)定30 min后給予不同濃度的DMSO(0、0.30%、3.00%、10.00%，每個濃度6 mL/min，持續(xù)給藥10 min后濃度梯度連續(xù)給藥，n=12)，觀察DMSO對心臟功能的影響，結(jié)果顯示，對照組的LVDP為(38.34±1.27)mm Hg，0.30% DMSO作用后的LVDP為(38.21±1.16)mm Hg，3.00% DMSO作用后的LVDP為(33.54±1.54)mm Hg，10.00% DMSO作用后的LVDP為(31.81±1.32)mm Hg，DMSO濃度依賴性地抑制LVDP，見圖4。DMSO濃度超過3.00%可明顯抑制豚鼠LVDP，同時DMSO濃度大于3.00%可明顯抑制dp/dtmax，而對dp/dtmin沒有明顯的抑制作用，見圖5。

*：P<0.05，**：P<0.01，與對照組比較；1：對照組;2：0.30% DMSO;3：3.00% DMSO;4:10.00% DMSO

圖2 DMSO對離體灌流豚鼠心臟心率的影響(n=12)

A：對照組；B：0.30% DMSO；C：3.00% DMSO；D：10.00% DMSO

圖3 DMSO對離體灌流豚鼠心臟心電圖的影響(n=12)

A：對照組；B：0.30% DMSO；C：3.00% DMSO；D：10.00% DMSO

圖4 DMSO對Langendorff灌流豚鼠心臟LVDP的影響(n=12)

A：LVDP；B：dp/dtmax；C：dp/dtmin；*：P<0.05，**：P<0.01，與對照組比較；1：對照組;2：0.30% DMSO;3：3.00% DMSO;4:10.00% DMSO

圖5 DMSO對Langendorff灌流豚鼠心臟功能的影響(n=12)

3 討 論

DMSO因具有特殊溶媒效應(yīng)且易于溶解多種不易溶于水的物質(zhì)，故被稱為“萬能溶劑”。DMSO應(yīng)用極為廣泛，是最為常見的溶劑之一，然而也有研究發(fā)現(xiàn)DMSO具有一定的細(xì)胞毒性。有研究顯示，濃度大于0.25%的DMSO對Min6胰島細(xì)胞的活力具有抑制作用[6]；DMSO對體外培養(yǎng)的眼組織也有一定的毒性[7]；DMSO濃度大于0.6%可顯著影響胚胎的發(fā)育[8-9]；DMSO劑量依賴性地對耳蝸毛細(xì)胞具有毒性作用[10]。DMSO大于0.8%可明顯抑制骨髓瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[11]。也有研究發(fā)現(xiàn)，DMSO對Langendorff灌流的心肌具有正性或負(fù)性肌力作用，可抑制神經(jīng)傳導(dǎo)速度，抑制鈉鉀泵的活性[12]。在C57BL/6小鼠的體內(nèi)(0.3 mL/kg)和體外實(shí)驗(yàn)(0.5%和1.0%)中均證實(shí)DMSO可導(dǎo)致海馬神經(jīng)元的細(xì)胞凋亡。DMSO具有對海馬腦片的抗谷氨酸神經(jīng)毒性作用[13-14]?？剐穆墒СＫ幬锒鄶?shù)不溶于水，以DMSO作為溶劑，因此研究DMSO對心肌功能的影響尤為重要，有利于正確評價心血管藥物及其他藥物的有效性和細(xì)胞毒性。

本研究證實(shí)，濃度大于3.00%的DMSO作用24 h后可明顯抑制體外心肌細(xì)胞培養(yǎng)條件下的心肌細(xì)胞存活率，且具有明顯的濃度依賴性。隨著DMSO濃度的增高不僅心肌細(xì)胞的存活率降低，而且心肌細(xì)胞的數(shù)量也明顯減少，死亡細(xì)胞逐漸增多。這些結(jié)果表明，濃度超過3%的DMSO對心肌細(xì)胞有一定的毒副作用，在使用DMSO的過程中濃度應(yīng)盡量低于3%，<1%相對安全。而在作為溶劑用于心血管系統(tǒng)的研究中也需要特別注意DMSO的濃度，在溶質(zhì)能溶解的條件下，盡量減少DMSO的量，DMSO不僅本身會影響心肌細(xì)胞的活性，減少心肌細(xì)胞的數(shù)量，而且可導(dǎo)致滲透壓的變化，也會影響心肌細(xì)胞的活性。已有研究證實(shí)，DMSO確實(shí)能改變灌流心臟臺式液的滲透壓，1% DMSO可導(dǎo)致滲透壓升高1.5倍[2]。也有研究表明，在視網(wǎng)膜神經(jīng)元細(xì)胞系細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)DMSO濃度大于1%明確具有細(xì)胞毒性，可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的損傷[3]。

在Langendorff灌流的豚鼠心臟上，本研究發(fā)現(xiàn)3.00%和10.00%的DMSO均能明顯降低豚鼠心率、LVDP和dp/dtmax。LVDP和dp/dtmax主要反映左心室的收縮功能，dp/dtmin主要反映左心室舒張功能。本研究結(jié)果表明，濃度超過3%的DMSO可通過減慢心率，降低室內(nèi)壓來明顯降低心臟的收縮功能。而且，早在1995年就有研究發(fā)現(xiàn)5% DMSO可延長豚鼠乳突心室肌動作電位時程(APD)，15%、10% DMSO可延長APD達(dá)33%。相反，MAN等[15]發(fā)現(xiàn)DMSO(0.2%～0.8%)預(yù)處理可降低過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的損傷，降低心肌細(xì)胞的存活率，減少心肌細(xì)胞的凋亡和降低半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的表達(dá)。本研究還發(fā)現(xiàn)DMSO濃度在高達(dá)10.00%時可致ST段延長，ST段和T波形態(tài)發(fā)生改變，這表明DMSO可能會導(dǎo)致心肌損傷或心肌缺血。

有關(guān)DMSO對心肌的損傷影響的研究較少，本研究結(jié)果與MAN等[15]的結(jié)果不一致可能是由于DMSO濃度范圍的差異。低濃度的DMSO(一般情況小于1.00%)可能具有一定的降低損傷心肌凋亡的作用，但超過1.00%，特別是高于3.00%可明顯降低心肌的存活率、減慢心率和降低室內(nèi)壓，增加心肌的損傷。因此DMSO作為溶劑時需嚴(yán)格控制其濃度，以減少DMSO對心臟功能的影響。