熒光定量PCR對(duì)FEN1敲低細(xì)胞株轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的驗(yàn)證*

蘇 倩，吳 潔，杜佳慧，楊 凡，袁濮玉，劉松柏，邱秀芹

(蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院蘇州檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘇州 215009)

DNA分枝結(jié)構(gòu)特異性內(nèi)切酶-1(flap endonuclease 1，F(xiàn)EN1)作為一個(gè)結(jié)構(gòu)特異性核酸酶，除在DNA復(fù)制中起著至關(guān)重要的作用外，在DNA損傷修復(fù)過(guò)程中也起著重要作用[1-4]。目前闡述得較清楚的是在堿基錯(cuò)配修復(fù)(base excision repair，BER)及Pol α合成錯(cuò)配修復(fù)通路(α-segment error editing，AEE)中的功能[1-5]。前期研究結(jié)果顯示，F(xiàn)EN1純合敲除小鼠胚胎致死，說(shuō)明FEN1功能的重要性[6]。為研究FEN1在細(xì)胞代謝過(guò)程中的具體功能，研究人員往往采用轉(zhuǎn)染外源FEN1表達(dá)質(zhì)?；蚋蓴_RNA進(jìn)入細(xì)胞，通過(guò)升高或降低FEN1表達(dá)的方式研究FEN1在不同條件下的具體功能[7-9]。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)又稱RNA測(cè)序(RNA-sequencing，RNA-Seq)，是指利用高通量測(cè)序技術(shù)，快速全方位地獲取在某一條件下某一物種特定組織及器官幾乎全部轉(zhuǎn)錄本，目前廣泛應(yīng)用于針對(duì)不同條件下細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)水平差異的檢測(cè)，從而研究條件改變引起基因表達(dá)改變的群簇，為從分子機(jī)制上闡明細(xì)胞表型改變的內(nèi)在驅(qū)動(dòng)力提供依據(jù)[10]。熒光定量PCR技術(shù)自開(kāi)發(fā)應(yīng)用以來(lái)，因?yàn)殪`敏、準(zhǔn)確、高效、特異等特點(diǎn)一直被作為對(duì)特定組織細(xì)胞中特定基因數(shù)量進(jìn)行定量的金標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)經(jīng)常被用來(lái)驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果[11]。為全面研究FEN1在細(xì)胞中的具體功能，本研究從前期FEN1基因敲低細(xì)胞株及對(duì)照細(xì)胞株的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中篩選若干個(gè)差異表達(dá)的基因，設(shè)計(jì)引物，利用熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證，為進(jìn)一步具體分析研究轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 人腎上皮細(xì)胞系293T細(xì)胞和本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的FEN1敲低細(xì)胞SG67。

1.1.2主要儀器與試劑 DMEM(高糖)培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶均購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；FEN1鼠源一抗、羊抗鼠辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗購(gòu)自美國(guó)Genetex公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TakaRa公司；SYBR Green熒光定量PCR試劑購(gòu)自瑞士羅氏公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行合成。ABI Step One Plus 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 293T細(xì)胞和SG67細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后，接種于50 mL培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃ 5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。80%細(xì)胞融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2總RNA的提取 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，用PBS吹細(xì)胞，收到1.5 mL EP管中，3 000 r/min離心1 min，棄上清液，置于-80 ℃冰箱中或者立即實(shí)驗(yàn)。加入適量的Trizol試劑，使細(xì)胞充分裂解；室溫靜置5 min后，轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中；振蕩器劇烈混勻15 s，室溫放置3 min；再在4 ℃條件下10 000 r/min離心15 min；提取上清液，在裝有上清液的EP管中加入等體積異丙醇溶液，充分混勻，室溫靜置15～20 min；在4 ℃條件下10 000 r/min離心10 min，離心后管底絮狀沉淀即為RNA。用無(wú)RNase水溶解稀釋RNA樣品，紫外吸收法測(cè)定總RNA的濃度及純度，樣品RNA 260 nm與280 nm處吸光度(A)值比值(A260/A280)為1.8～2.1之間。變性瓊脂糖凝膠電泳評(píng)估總RNA的完整性。

1.2.3反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明先配制10 μL體系：Oligo dT 2 μL、dNTP 2 μL、RNA 4 μL、無(wú)RNase雙蒸水(ddH2O)12 μL。65 ℃，5 min，冰上急冷2 min；取上述溶液20 μL，加入5×primer script buffer 8 μL、RNase inhibifor 1 μL、Primer script 2 μL、無(wú)RNase ddH2O 9 μL，配成總體系40 μL。PCR儀上設(shè)計(jì)程序：30 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，70 ℃ 15 min，4 ℃ 10 min。所得溶液置于-20 ℃保存。

1.2.4熒光定量 PCR 表達(dá)驗(yàn)證

1.2.4.1轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 通過(guò)Ⅰllumina Hiseq 2500高通量測(cè)序平臺(tái)測(cè)序，在RNA序列分析中，可將定位到基因組區(qū)域的序列數(shù)量作為計(jì)算基因的表達(dá)水平。為了解293T(Ctrl)和293T的FEN1敲低細(xì)胞(FEN1KD)中基因表達(dá)差異情況，本研究采用RSEM軟件計(jì)算基因表達(dá)水平，衡量基因表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)為FPKM值。在構(gòu)建cDNA文庫(kù)時(shí)，F(xiàn)PKM值將隨機(jī)打斷的片段作為分析單位，并把FPKM值作為基因在細(xì)胞中的表達(dá)水平。3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果找出差異表達(dá)的基因。

1.2.4.2引物設(shè)計(jì) 根據(jù)高通量測(cè)序結(jié)果，篩選出10個(gè)預(yù)測(cè)有表達(dá)差異基因序列，利用 Primer premier5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并經(jīng)上海生工生物工程有限公司進(jìn)行合成。通過(guò)常規(guī)PCR反應(yīng)對(duì)目的片段進(jìn)行擴(kuò)增，并摸索反應(yīng)最適條件。具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程根據(jù)Takara PCR試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。引物信息見(jiàn)表1。

表1 PCR引物信息

1.2.4.3熒光定量PCR 采用SYBR Green Ⅰ法進(jìn)行熒光定量PCR，驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，嚴(yán)格按照羅氏熒光定量反應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。每個(gè)模板設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)基因設(shè)置3個(gè)陰性對(duì)照，總反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件：95 ℃ 15 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。獨(dú)立3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。熒光定量PCR擴(kuò)增挑選基因所用引物與表1引物序列相同。

2 結(jié) 果

2.1FEN1敲低細(xì)胞系驗(yàn)證 通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)293T細(xì)胞和SG67細(xì)胞表達(dá)FEN1蛋白情況，結(jié)果顯示與對(duì)照293T細(xì)胞相比，SG67細(xì)胞的FEN1蛋白表達(dá)水平明顯下降，見(jiàn)圖1。

M:蛋白標(biāo)記物

圖1 FEN1敲低細(xì)胞株SG67的FEN1蛋白表達(dá)

2.2轉(zhuǎn)錄組結(jié)果與分析 通過(guò)Ⅰllumina Hiseq 2500高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)293T(Ctrl)和293T的 FEN1敲低細(xì)胞(FEN1KD)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并從轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中篩選出10個(gè)差異表達(dá)的基因，其表達(dá)水平見(jiàn)表2。

表2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序預(yù)測(cè)的基因表達(dá)水平

續(xù)表2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序預(yù)測(cè)的基因表達(dá)水平

2.3篩選基因PCR擴(kuò)增結(jié)果 選取293T細(xì)胞的cDNA經(jīng)普通PCR擴(kuò)增10個(gè)基因，程序設(shè)定：95 ℃ 15 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，LC7A3、MAGEB2、HBE1、SLC6A11、ITPKB、SPINT和EVA1C等7個(gè)基因都有表達(dá)，且條帶單一，見(jiàn)圖2。

M：DL 2000；1：SLC7A3；2：MAGEB2；3：HBE1；4：SLC6A11；5：ITPKB；6：SPINT1；7：EVA1C

圖2 293T細(xì)胞中差異表達(dá)基因的PCR產(chǎn)物電泳圖

2.4篩選基因熒光定量檢測(cè)結(jié)果 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及普通PCR結(jié)果，選取在兩種細(xì)胞中差異表達(dá)并經(jīng)普通PCR擴(kuò)增的條帶單一的7個(gè)基因，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)這7個(gè)基因分別在293T和SG67細(xì)胞中的表達(dá)情況，每個(gè)基因的擴(kuò)增進(jìn)行了3次實(shí)驗(yàn)重復(fù)。熒光定量PCR結(jié)果顯示與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果基本一致。利用定量PCR檢測(cè)方法發(fā)現(xiàn)ITPKB與EVA1C基因在兩種細(xì)胞株中表達(dá)雖然有差異，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3、圖3。

*：P<0.05，與Ctrl比較

圖3與Ctrl比較FEN1KD熒光定量數(shù)據(jù)分析結(jié)果

表3 與Ctrl比較FEN1KD熒光定量數(shù)據(jù)分析結(jié)果

3 討 論

基因組DNA攜帶著生命近乎完整的信息，卻時(shí)刻面臨著各種的損傷危險(xiǎn)。這些致使DNA損傷的因素包括來(lái)自內(nèi)源的代謝產(chǎn)物與來(lái)自體外環(huán)境來(lái)源的持續(xù)攻擊[12-13]。FEN1作為分枝結(jié)構(gòu)特異性核酸酶，在DNA復(fù)制岡崎片段成熟過(guò)程中起著不可替代的作用。同時(shí)，F(xiàn)EN1在DNA修復(fù)通路中也具有重要作用。FEN1純合敲除小鼠模型胚胎致死。因此，為研究FEN1在低表達(dá)情況下細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)差異，以及所影響的細(xì)胞內(nèi)代謝通路改變情況，本課題組前期構(gòu)建了FEN1敲低細(xì)胞株SG67，并利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法對(duì)SG67及野生型對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組水平基因差異表達(dá)比較，獲取了大量的基因表達(dá)差異數(shù)據(jù)。

為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的可靠性，本研究采用了目前相對(duì)靈敏、準(zhǔn)確的熒光定量PCR方法。從選擇的10個(gè)差異基因中，成功設(shè)計(jì)了其中7個(gè)基因的擴(kuò)增引物，并得到了單一可靠的DNA條帶。熒光定量分析結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果相比較，7個(gè)基因的表達(dá)差異性均為一致。然而，ITPKB與EVA1C兩個(gè)基因利用熒光定量PCR方法在兩種細(xì)胞株中檢測(cè)到表達(dá)有差異，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，反映轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)后續(xù)定量PCR檢驗(yàn)的必要性。另外檢測(cè)的5個(gè)基因中，SLC7A3及SLC6A11均屬于可溶性載體蛋白家族，對(duì)氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)具有重要作用[14]。MAGEB2基因?qū)儆诤谏亓龀?jí)家族成員，在腫瘤的發(fā)生過(guò)程中起重要作用[15]。HBE1基因?yàn)檠t蛋白的一個(gè)亞基，連同以上幾個(gè)基因均在FEN1敲低細(xì)胞株中表達(dá)下降，說(shuō)明FEN1的下降導(dǎo)致蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)功能受阻，腫瘤發(fā)生等相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生改變。在FEN1敲低細(xì)胞株中表達(dá)上調(diào)的SPINT1基因?qū)儆诩?xì)胞生長(zhǎng)因子激活物的抑制劑，具體調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究[16]。

綜上所述，本研究為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)、分析轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的可行性奠定了基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研究FEN1在細(xì)胞內(nèi)的代謝通路情況奠定了基礎(chǔ)。