辣椒醬發(fā)酵過(guò)程中蛋白酶活性變化的研究

洪 玲

(新田縣市場(chǎng)監(jiān)督檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖南 永州 425700)

辣椒自明朝時(shí)傳入中國(guó)后就開(kāi)始在華夏的土地上廣泛種植，后成為菜品中必備的一種蔬菜，從古代一直流傳至今，而目前辣椒的種植已經(jīng)遍布全世界，成為各國(guó)人民佐餐必不可少的一種重要原料。辣椒中含有辣椒堿，其包括多種不同結(jié)構(gòu)的化學(xué)物質(zhì)如辣椒素、降二氫辣椒堿等[1]，王夢(mèng)等[2]將幾種辣椒素單同維生素E做對(duì)比，發(fā)現(xiàn)辣椒堿單位物質(zhì)都具有明顯的抗氧化性，但這類(lèi)物質(zhì)雖會(huì)刺激口腔和皮膚讓人產(chǎn)生痛覺(jué)，但可以增進(jìn)食欲，促進(jìn)人體血液循環(huán)，更新細(xì)胞，使皮膚保持年輕狀態(tài)，改善寒涼體質(zhì)。同時(shí)富含維生素，尤其是VC含量，平均約為180 mg/100 g以上[3]，紅辣椒中還含有辣椒紅色素[4]，這是一種混合物主要成分是葉黃素中的不同分子成分，可以作為食品的著色劑，顏色亮麗、無(wú)毒無(wú)害，還具有抗氧化的特性。

辣椒的加工目前應(yīng)用最多的是初級(jí)加工，如制成干辣椒；既能長(zhǎng)期儲(chǔ)存又能用于調(diào)味，諶智鑫等考察了不同儲(chǔ)藏環(huán)境對(duì)干辣椒品質(zhì)的影響；制成油辣椒；貴州省知名品牌的老干媽就是將辣椒進(jìn)行油炸后制成的調(diào)味品，張學(xué)君等發(fā)明了一種油辣椒的制作方法，具有香辣口感、保質(zhì)期長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn)。而要想獲得高附加值的產(chǎn)品還要對(duì)辣椒進(jìn)行深加工，比如提取辣椒堿、辣椒素，有研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)稀釋的辣椒素具有美白皮膚的作用，可以制成化妝品使用[5-10]。而目前應(yīng)用最廣泛的是將辣椒制成辣椒醬[11]， 用油脂煎炸辣椒，待五分熟后，加入黃豆醬制成簡(jiǎn)單的家庭食用的熟醬，既具有典型的豆醬香味又有辣椒的味道和口感。而目前辣椒醬的制作已經(jīng)發(fā)展到加入多種香辛料如生姜、大蒜、花椒甚至西紅柿等[12]，以及加入糖、食鹽、黃酒等，由微生物發(fā)酵制成調(diào)味品，相似的產(chǎn)品還有糟辣椒[13]，辣椒醬不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，通過(guò)微生物發(fā)酵的方式制成的風(fēng)味發(fā)酵制品更具有市場(chǎng)前景。本實(shí)驗(yàn)以辣椒醬工藝為研究對(duì)象，考察并分析了辣醬制作過(guò)程中蛋白酶活性值的變化趨勢(shì)，找出發(fā)酵型辣椒醬適宜的發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間。

1 實(shí)驗(yàn)原理

1.1 酶活測(cè)定實(shí)驗(yàn)原理

分光光度法是酶活力研究常用的方法，酶促反應(yīng)中的底物常含有光譜紫區(qū)光學(xué)吸收的不飽和自由基。反應(yīng)底物的濃度以在特定波長(zhǎng)的吸收量來(lái)測(cè)量，而酶反應(yīng)的進(jìn)展則根據(jù)光吸收的變化來(lái)測(cè)量。本實(shí)驗(yàn)主要利用該原理測(cè)定辣椒醬發(fā)酵過(guò)程中的蛋白酶活性，如梅源等通過(guò)測(cè)定不同菌種接種霉豆瓣后考察在發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌種以及蛋白酶活性，提高醬醪質(zhì)量，確定最佳發(fā)酵菌種以及生產(chǎn)工藝[14]。

1.2 DGGE鑒定微生物群落原理

DGGE(變性梯度凝膠電泳)是根據(jù)DNA在不同濃度的變性劑中解鏈行為的不同而導(dǎo)致電泳遷移率發(fā)生變化，從而將片段大小相同而堿基組成不同的DNA片段分開(kāi)。因此DGGE能將同樣大小的DNA片段很理想地分開(kāi)，它是一種可以確定發(fā)酵產(chǎn)品如酒醅、醋醅、醬醪基質(zhì)發(fā)酵過(guò)程中微生物群落演替的一種分子標(biāo)記方法?，F(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生物多樣性調(diào)查、親緣關(guān)系鑒定、基因突變檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域。DGGE/TGGE已廣泛用于分析自然環(huán)境中細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌、古菌、微型真核生物、真核生物和病毒群落的生物多樣性[15，16]。

1.3 辣椒醬制作過(guò)程

挑選一定數(shù)量的大豆，除去可見(jiàn)的顆粒物，挑選飽滿(mǎn)、無(wú)腐爛和破損的顆粒。用清水沖洗，然后用清水浸泡，浸泡時(shí)間約為24 h，確保豆皮出現(xiàn)褶皺。將浸泡過(guò)的大豆濾出水分，放入蒸煮鍋中，直到幾乎變軟為止。根據(jù)配方要求蒸好的大豆將和蒸好的面粉混合后接入種曲，送入曲房。原料混合均勻，接種均勻，接種量0.3%，確保曲料疏松均勻地播撒，厚薄均勻。入曲后馬上進(jìn)行翻曲，然后將面粉均勻地撒在紗布上，使其自然發(fā)酵，直到菌絲變成黃綠色。挑大小合適的辣椒，要求成熟、不腐爛。清洗，從中間切成兩半，用勺子把肉挖出來(lái)，切成約2 cm的小塊，放入托盤(pán)中供日后使用。最后，用天平稱(chēng)重225 g的小辣椒、45 g的豆腐、10 g的生姜，并將適量的辣椒和八角混合。將混合好的原料放入罐中，在實(shí)驗(yàn)要求的條件下發(fā)酵,實(shí)驗(yàn)流程見(jiàn)圖1。

圖1 辣椒醬工藝流程圖Fig.1 Process flow chart of chili sauce

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

丙烯酰胺/甲叉(37.5∶1)、尿素、100%去離子甲酰胺、50×TAE緩沖液、10 mg/mL溴化乙錠、2×膠上樣染料、過(guò)硫酸銨、TEMED：上海生工集團(tuán)有限公司；酪蛋白：美國(guó)Sigma公司。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

將0.3 g瓊脂糖溶解于30 mL的1×TAE緩沖溶液中，加熱溶解(微波爐加熱或沸水浴加熱，至瓊脂糖溶解)，稍微降溫后加入3 μL的核酸染料，混勻后倒入托盤(pán)中，插入梳子，約0.5 h后其冷卻。將凝膠放入電解槽中，加樣(加有l(wèi)oading buffer的DNA樣品)，在5 V/cm電壓下電泳30 min。在紫外光下觀察電泳條帶。

反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，65 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃最終延伸5 min。將不同發(fā)酵過(guò)程的醬醪在容器不同部分取10份，使用DNA提取試劑盒進(jìn)行提取，PCR產(chǎn)物全部進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外光下用無(wú)菌刀割下含目的DNA片段的瓊脂糖塊，稱(chēng)重，放入1.5 mL的離心管中，用DNA純化通用試劑盒純化PCR產(chǎn)物，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度。反應(yīng)體系見(jiàn)表1。

表1 25 mL PCR 反應(yīng)體系Table 1 25 mL PCR reaction system

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱(chēng)重1 g蛋白酶，用少量磷酸鹽緩沖液溶解后用玻璃棒研磨，然后將上液倒入100 mL的容量瓶中，再用玻璃棒在沉積物中加入少量緩沖，最后全部轉(zhuǎn)移到容量瓶中，稀釋到指定的比例，用4層紗布過(guò)濾。該酶已稀釋100倍，濾液可直接用作試驗(yàn)酶。根據(jù)表2準(zhǔn)備l-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

表2 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液比率表Table 2 Standard solution ratio table of amino acid

2.4 樣品測(cè)定

取上述每個(gè)溶液1.00 mL，在每個(gè)溶液中加入0.4 mol/L碳酸鈉溶液5.00 mL，不同濃度試劑溶液1.00 mL，放入(40±0.2) ℃恒溫水浴2 min，然后在波長(zhǎng)680 nm用分光光度計(jì)測(cè)OD值，比色法去除，以無(wú)酪氨酸零管作為空白管，分別調(diào)整零點(diǎn)，測(cè)吸收度值，以吸收度值作為縱坐標(biāo)，酪氨酸濃度作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或計(jì)算回歸方程。在OD為1時(shí)計(jì)算酪氨酸的量(μg)，即吸光度常數(shù)k值，其k值應(yīng)在95～100之間。將2%的酪蛋白溶液置于(40±0.2) ℃的恒溫水浴中，預(yù)熱5 min；取4管，加入1 mL的酶解液,取1根作為空白管，加入2 mL的三氯乙酸溶液，在其他3個(gè)試管中各加入3 mL的酪蛋白溶液，搖勻，保持在40 ℃，持續(xù)10 min；取出試管，在3個(gè)試管中各加入2 mL的三氯乙酸溶液，在空白試管中加入1 mL的酪蛋白溶液，靜止10 min后，沉淀落到試管底部，從每個(gè)管中取出1 mL的濾液，分別加入5 mL的Na2CO3溶液和1 mL的福林試劑溶液。顏色是在40 ℃的恒溫水浴中培養(yǎng)20 min后形成的，OD值在680 nm波長(zhǎng)下測(cè)量，用空管調(diào)整零點(diǎn)，使用Excel軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖2。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2 Standard curve diagram

3 分析與討論

表3 短期內(nèi)不同培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間的蛋白酶活力變化值Table 3 Changes of protease activity at different culture temperatures and culture time in a short term

圖3 短期內(nèi)辣椒醬發(fā)酵過(guò)程蛋白酶活力變化圖Fig.3 Change chart of protease activity in chili sauce fermentation in a short term

由表3和圖3可知，在辣椒醬制作過(guò)程中，在同一發(fā)酵日內(nèi)，第1天在3種不同溫度下測(cè)得的豆腐的蛋白酶活性值不高，而第2天的蛋白酶活性含量變化的速率增加，第3天在3個(gè)溫度下測(cè)得的蛋白酶活性持續(xù)上升，達(dá)到了活動(dòng)的峰值和最高值。其中蛋白酶活性值最高為35 ℃，其次為40 ℃，在室溫下蛋白酶活性值最低為30 ℃。第4天活動(dòng)值下降，但變化不明顯。第5天開(kāi)始急劇下降，蛋白酶活力最低。在相同的溫度條件下(30，35，40 ℃)，第1～3天，蛋白酶活力變化呈直線上升的趨勢(shì)，第3天達(dá)到高峰，這是蛋白酶的最高值。第4天呈下降趨勢(shì)，第5天的變化值趨于穩(wěn)定。

表4 長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)條件下不同培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間的蛋白酶活力變化值Table 4 Changes of protease activity at different culture temperatures and culture time under long-termculture condition

圖4 長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)條件下不同培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間的蛋白酶活力變化圖Fig.4 Change chart of protease activity at different culturetemperatures and culture time under long-termculture condition

由表4和圖4可知，在同一發(fā)酵日內(nèi)，第1天在3種不同溫度下測(cè)得的辣椒醬醬醪中的蛋白酶活性值不大，并且在第5天蛋白酶活性值的變化率加速，在3個(gè)溫度下測(cè)得的蛋白酶活性值繼續(xù)呈線性上升，并在第20天達(dá)到峰值，活性值最高。其中蛋白酶活性值最高為40 ℃，其次為35 ℃，在室溫下蛋白酶活性值最低為30 ℃。在第25天，活動(dòng)值下降，但變化不明顯。在第30天，活動(dòng)值開(kāi)始持平。在相同溫度條件下(30，35，40 ℃)，從第1～12天，基本上呈穩(wěn)定上升趨勢(shì)，在第20天達(dá)到最高值，蛋白酶活性值最高。25天的變化值略有下降，30天的變化值趨于持平。

不同發(fā)酵時(shí)間辣椒醬醪的DGGE圖譜見(jiàn)圖5。

圖5 不同發(fā)酵時(shí)間辣椒醬醪DGGE電泳圖Fig.5 DGGE electrophorograms of chili sauce mashat different fermentation time

圖5中A為前5 d辣椒醬醬醪中微生物群落分布，可以看出變化基本不大，微生物群落以及生物量基本一致。圖5中B為10～40 d發(fā)酵過(guò)程中微生物群落變化圖，其中第10天微生物構(gòu)成最為豐富，15～30 d之間微生物群落變化較小，從第35天開(kāi)始微生物群落變化很小。連同蛋白酶的變化數(shù)據(jù)可以看出，后期產(chǎn)蛋白酶的真菌逐漸被乳酸菌等多種不同種類(lèi)細(xì)菌逐漸取代。周雯君等[17]通過(guò)測(cè)定醬油曲中的中性蛋白酶活性進(jìn)行跟蹤，可以根據(jù)其數(shù)據(jù)判定豆醬是否成熟以及在不同發(fā)酵階段的典型微生物群落構(gòu)成。梁晉維等[18]通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)考察了篩選得到的米曲霉AspergillusoryzaeNCFEC03產(chǎn)蛋白酶的最優(yōu)條件，因?yàn)槎贯u起始必須有足夠的蛋白酶降解蛋白質(zhì)才能得到高品質(zhì)的成品醬。童佳[19]通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定了米曲霉產(chǎn)蛋白酶的規(guī)律支持了這種結(jié)果。樊君等[20]通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定圓盤(pán)制曲過(guò)程中蛋白酶活力值的最優(yōu)條件，以期能夠正確、有效地指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)。朱永清等[21]使用DGGE技術(shù)分析了不同豆醬樣品中微生物真菌菌群結(jié)構(gòu),以期獲得高品質(zhì)豆醬同微生物群落之間的關(guān)系。高秀芝等[22]使用DGGE方法測(cè)定了東北傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中微生物群落的動(dòng)態(tài)變化，確定了不同發(fā)酵時(shí)間微生物群落變化，其研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相似。

4 討論

在不同的溫度條件和發(fā)酵天數(shù)下，測(cè)定了辣椒醬中蛋白酶在發(fā)酵過(guò)程中不同時(shí)間內(nèi)的活性變化值。在辣椒醬制作過(guò)程中，蛋白酶的活性值在相同溫度條件下第3天最高，35 ℃的蛋白酶活性值在相同發(fā)酵日內(nèi)最高?？梢?jiàn)在制作辣椒醬的過(guò)程中，適宜的發(fā)酵溫度為35 ℃，適宜的發(fā)酵天數(shù)為3 d。在制作醬料的過(guò)程中，在同一溫度條件下，蛋白酶活性在第20天最高；在同一發(fā)酵日內(nèi)，辣椒醬的蛋白酶活性最高；可見(jiàn)在制作辣椒醬的過(guò)程中，適宜的發(fā)酵溫度為40 ℃，適宜的發(fā)酵天數(shù)為20 d。