四波長(zhǎng)融合指紋圖譜評(píng)價(jià)金卷升板膠囊質(zhì)量*

王玲嬌 ，楊 亮 ，張振杰，于 靜△，楊繼章，孫國(guó)祥，周春華

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，河北 石家莊 050031； 2.沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016）

金卷升板膠囊源自河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院血液科劉清池主任醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)方，由金銀花、黃芩、地錦草、熟大黃等中藥材組方，有解毒散瘀、清熱涼血、止血通絡(luò)功效，主治原發(fā)性免疫性血小板減少癥（ITP）[1-2]?，F(xiàn)有文獻(xiàn)多報(bào)道以高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定處方中單味藥材代表成分及建立單味藥材單波長(zhǎng)指紋圖譜[3-4]，未見(jiàn)該制劑的指紋圖譜報(bào)道。多波長(zhǎng)融合指紋圖譜可清晰、完整地揭示處方中有效成分的復(fù)雜物質(zhì)基礎(chǔ)，現(xiàn)已用于中藥成分分析[5-6]。本研究中建立了金卷升板膠囊的四波長(zhǎng)融合指紋圖譜，并對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行全面評(píng)價(jià)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1200 Series型高效液相色譜儀（美國(guó) Agilent公司）；BS 110S型分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；KQ-400KDE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；微孔濾膜（上海興亞凈化材料廠）。

1.2 試藥

沒(méi)食子酸對(duì)照品（批號(hào)為110710-200110，含量98%），綠原酸對(duì)照品（批號(hào)為110756-200102，含量98%），黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)為110755-200103，含量98%），蘆薈大黃素對(duì)照品（批號(hào)為110796-200802，含量98%），大黃素甲醚對(duì)照品（批號(hào)為110724-200613，含量98%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；金卷升板膠囊（河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，批號(hào)分別為170813、170826、170901、170914、170928、170834、170841、170855、170935、170959、170968，編號(hào)依次為 S1～S11，規(guī)格為每粒0.5 g）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.5% 乙酸水（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～10 min時(shí) 10%B→40%B，10～40 min時(shí) 40%B→70%B，40～55 min時(shí) 70%B→100%B，55～65 min時(shí) 100%B）；檢測(cè)波長(zhǎng)：254，275，330，360 nm；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

分別取沒(méi)食子酸對(duì)照品1.34 mg，綠原酸對(duì)照品6.19 mg，黃芩苷對(duì)照品6.46 mg，蘆薈大黃素對(duì)照品1.81 mg，大黃素甲醚對(duì)照品3.21 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，得混合對(duì)照品溶液。取樣品內(nèi)容物10粒，混勻，研細(xì)，取0.2 g，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加入約10 mL 70%甲醇，超聲（功率300 W，頻率40 Hz）處理30 min，降至常溫后，加70%甲醇定容，搖勻，濾過(guò)，得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

按標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行方法學(xué)考察，結(jié)果精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于3%，表明儀器精密度、方法重復(fù)性均良好，供試品室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 四波長(zhǎng)融合指紋圖譜分析

融合指紋圖譜建立：取11批樣品，依法制備11批供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，得HPLC圖譜，導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜超信息特征數(shù)字化評(píng)價(jià)系統(tǒng)4.0版軟件，得HPLC指紋圖譜（見(jiàn)圖1）。以黃芩苷峰為參照物峰，確定65個(gè)共有峰，其中5號(hào)峰為沒(méi)食子酸峰，12號(hào)峰為綠原酸峰，37號(hào)峰為黃芩苷峰，49號(hào)峰為蘆薈大黃素峰，64號(hào)峰為大黃素甲醚峰，按照平均值法生成對(duì)照指紋圖譜（RFP），見(jiàn)圖1。

金卷升板膠囊質(zhì)量評(píng)價(jià)：以生成的對(duì)照指紋圖譜為標(biāo)準(zhǔn)，采用系統(tǒng)指紋定量法依次計(jì)算11批樣品的宏定性相似度（Sm）、宏定量相似度（Pm）、均化系數(shù)（α）值，并區(qū)分金卷升板膠囊歸屬的質(zhì)量等級(jí)（見(jiàn)表1）。結(jié)果11批樣品均為合格品。

圖1 11批金卷升板膠囊指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜（RFP）

表1 金卷升板膠囊指紋質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果

兩種指紋圖譜質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果比較：不同批次的金卷升板膠囊樣品在融合后和4個(gè)單波長(zhǎng)下分別建立對(duì)照指紋圖譜，采用系統(tǒng)指紋定量法評(píng)價(jià)質(zhì)量（見(jiàn)表1）。結(jié)果表明，指紋信號(hào)均化性與對(duì)照指紋圖譜差異較小，但單波長(zhǎng)處指紋信息的不全會(huì)導(dǎo)致質(zhì)量等級(jí)評(píng)價(jià)一致性偏好，且區(qū)分度小，而綜合了特征圖譜的融合譜的質(zhì)量等級(jí)除S10外，其余均有所下降，但能更好地區(qū)別不同樣品的質(zhì)量等級(jí)，使試驗(yàn)結(jié)果更客觀真實(shí)。

3 討論

3.1 樣品提取方法選擇

預(yù)試驗(yàn)比較了乙醇超聲提取法、浸泡法和回流提取法對(duì)有效成分的影響，結(jié)果回流提取法和浸泡法的指紋圖譜峰數(shù)量在4個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)處均少于超聲提取法，且回流溫度過(guò)高，浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)均導(dǎo)致主要成分相對(duì)含量下降，部分成分被破壞和分解，故最終選擇超聲法進(jìn)行提取。

3.2 樣品提取溶劑選擇

預(yù)試驗(yàn)中，比較了不同比例的甲醇、乙醇在超聲條件下提取的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)甲醇提取的供試品溶液的色譜峰及分離度均優(yōu)于乙醇，因此采用甲醇進(jìn)行提取。70%甲醇提取的樣品在各個(gè)波長(zhǎng)的主要成分色譜峰面積均大于30%甲醇、50%甲醇及80%甲醇，故選擇70%甲醇作為提取溶劑。

3.3 融合指紋圖譜檢測(cè)波長(zhǎng)確定

預(yù)試驗(yàn)中對(duì)組方有效成分進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，最終選取254，275，330，360 nm這4個(gè)特征波長(zhǎng)處的色譜圖進(jìn)行融合。將11批樣品在4個(gè)波長(zhǎng)下的色譜信號(hào)分別導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜超信息特征數(shù)字化評(píng)價(jià)系統(tǒng)4.0版軟件[7-9]，以獲取較好的相似度和合適的指紋峰為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，選取軟件計(jì)算的最大值在融合時(shí)間窗0.2 min時(shí)融合4個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)下的色譜圖，得金卷升板膠囊各批次的融合指紋圖譜。

綜上所述，基于多波長(zhǎng)融合技術(shù)的系統(tǒng)指紋定量法可為金卷升板膠囊的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。