西南地區(qū)動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病患者阿司匹林抗血小板藥效相關(guān)基因多態(tài)性分析*

楚明明，王 強(qiáng)，張，鄒 朗，雷 健，張 蓉

（陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科，重慶 400037）

動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾?。ˋSCVD）被稱(chēng)為“發(fā)達(dá)國(guó)家居民健康的頭號(hào)殺手”，在發(fā)展中國(guó)家的發(fā)病率也日趨增高[1]。血小板的粘附、活化和聚集在ASCVD的病理生理過(guò)程中起重要作用。常用抗血小板聚集藥物阿司匹林是防治ASCVD的基石。2006年，美國(guó)預(yù)防服務(wù)工作組將服用阿司匹林作為心血管疾病高危人群成本效益和臨床價(jià)值較高的預(yù)防措施[2]。但部分患者服藥后出現(xiàn)阿司匹林抵抗（AR），發(fā)生率為5.5% ～60%[3]。AR受遺傳、細(xì)胞和臨床等多方面因素影響，目前有多種單核苷酸多態(tài)性（SNP）被報(bào)道與AR相關(guān)，如環(huán)氧合酶-1（COX-1）基因多態(tài)性、血小板糖蛋白（GP）Ⅱb/Ⅲa基因多態(tài)性、二磷酸腺苷（ADP）受體P2Y1基因多態(tài)性、血小板糖蛋白Ⅰa/Ⅱa受體基因多態(tài)性等[4-5]。本研究中通過(guò)分析 GPⅢaPLA2，PEAR1，PTGS1，GP1BA 4 個(gè)基因位點(diǎn)在西南地區(qū)人群中的突變情況，探討阿司匹林抗血小板藥效相關(guān)基因多態(tài)性的分布情況，為臨床實(shí)施個(gè)體化的阿司匹林治療方案提供依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取醫(yī)院心血管內(nèi)科2018年4月至9月收治的需口服阿司匹林治療的ASCVD患者358例（年齡18～80歲，性別不限）。排除有阿司匹林禁忌證，3個(gè)月內(nèi)發(fā)生過(guò)腦出血，1個(gè)月內(nèi)進(jìn)行過(guò)重大手術(shù)，以及嚴(yán)重感染、惡性腫瘤和免疫系統(tǒng)疾病患者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書(shū)。

1.2 儀器與試藥

儀器：Fluotec 48E型微量熒光檢測(cè)儀（西安天隆科技有限公司）；SorvallTMLegendTMMicro 17R型離心機(jī)（Thermo Scientific公司）；LX-300型迷你離心機(jī)和Vortex-5漩渦混合器（海門(mén)其林貝爾儀器制作有限公司）。

試藥：阿司匹林腸溶片（Bayer Vital GmbH，進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)H20130339，規(guī)格為每片100 mg）。測(cè)序反應(yīng)通用試劑盒（北京華夏時(shí)代基因科技發(fā)展有限公司）。

1.3 阿司匹林抗血小板藥效相關(guān)基因多態(tài)性檢測(cè)

采集患者靜脈血2 mL，置乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中，經(jīng)裂解、結(jié)合、洗滌、洗脫、純化，得樣本DNA片段，然后經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)焦磷酸測(cè)序法測(cè)定基因多態(tài)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。正態(tài)分布的連續(xù)性變量以±s表示，行雙側(cè)t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分率（%）表示，行 χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 阿司匹林抗血小板藥效相關(guān)基因檢測(cè)

358例患者中，GPⅢaPLA2（T＞C）基因均為野生型，無(wú)突變；PEAR1（G ＞A）基因野生（GG）型 111例，突變雜合（GA）型 180例，突變純合（AA）型67例，突變率68.99%；PTGS1（-842A ＞G）基因野生（AA）型 356例，突變雜合（AG）型 2 例，突變率 0.56%；GP1BA（5792C＞T）基因野生（CC）型307例，突變雜合（CT）型48例，突變純合（TT）型3例，突變率14.25%。詳見(jiàn)表1。

表1 阿司匹林抗血小板藥效相關(guān)基因檢測(cè)結(jié)果[例（%）]

2.2 患者基因型一般資料

統(tǒng)計(jì)患者基因型時(shí)，排除2例PTGS1位點(diǎn)突變雜合型，基于GPⅢа PLA2和PTGS1均為野生基因型，依據(jù)PEAR1和GP1BA基因型分組。PEAR1基因野生型111例（31.18%），突變型 245 例（68.82%），GP1BA 基因野生型305例（85.67%），突變型51例（14.33%）。納入患者按基因型的不同分組，野生組與突變組患者一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。詳見(jiàn)表2。

表2 患者基因型基線信息

3 討論

阿司匹林是治療和預(yù)防心腦血管疾病的主要藥物，但部分患者即使規(guī)律服用阿司匹林仍會(huì)發(fā)生AR。目前，AR的發(fā)生機(jī)制尚未研究清楚，以往研究提示，抗血小板藥物代謝及作用過(guò)程中涉及的相關(guān)基因多態(tài)性可能是重要因素。研究較多的阿司匹林代謝相關(guān)基因有COX、血小板膜糖蛋白、PEAR1及PTGS1等。

COX以COX-1和COX-2兩種同工型存在，在前列腺素合成過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。阿司匹林可使COX-1乙酰化失活，抑制血栓素A2的產(chǎn)生，阻止血小板聚集。MAREE等[6]的研究表明，攜帶COX-1突變體842G等位基因的患者更易出現(xiàn)AR。LEP?NTALO等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，COX-1基因842位點(diǎn)G等位基因在AR患者中的分布頻率顯著升高，血小板聚集和血栓素水平顯著增加，故推斷G等位基因與AR的發(fā)生相關(guān)。

血GP受體GPⅢa基因外顯子2第1 565位基因突變后，GPⅢa蛋白33位點(diǎn)亮氨酸（PLA1）被脯氨酸（PLA2）置換，影響血小板的最終激活。SZCZEKLIK等[8]監(jiān)測(cè)了攜帶PLA等位基因的80名健康男性服用阿司匹林前后出血時(shí)間的改變，結(jié)果攜帶PLA2等位基因的人出血時(shí)間較攜帶PLA1等位基因者短，提示攜帶PLA2等位基因者更易發(fā)生AR。GPIb是由 GPIbα和GPIbβ 2個(gè)亞基構(gòu)成，其表達(dá)減少會(huì)引發(fā)血小板的聚集和釋放。FUJIWARA等[9]發(fā)現(xiàn)，在110例健康男性受試者中，血小板膜 GP1bα多肽（GPIBA）基因型為CC或CT的，與基因型為T(mén)T的相比，AR風(fēng)險(xiǎn)增加。

PEAR1是表達(dá)在血小板和內(nèi)皮細(xì)胞上的1型膜蛋白，該受體的磷酸化可能促進(jìn)血小板脫顆粒，引起血小板之間不可逆的聚集反應(yīng)。WüRTZ等[10]的研究表明，攜帶PEAR1基因rs12041331位點(diǎn)A等位基因的患者服用阿司匹林時(shí)，發(fā)生心肌梗死及死亡的比例升高。LEWIS等[11]研究發(fā)現(xiàn)，PEAR1基因rs12041331位點(diǎn)A等位基因攜帶者，在單用阿司匹林或聯(lián)用氯吡格雷行抗血小板治療時(shí)，心血管事件發(fā)生率及死亡率均顯著升高。研究提示[12]，PEAR1的野生G基因的基因頻率為0.61，突變A基因的基因頻率為0.39。石秀錦等[13]的研究表明，中國(guó)人群中PEAR1的野生G基因的基因頻率為0.624，突變A基因的基因頻率為0.376，與本研究結(jié)論一致。本研究中，GP1BA基因存在突變，突變率為14.25%。GPⅢaPLA2和PTGS1兩個(gè)基因的突變率較低，與石秀錦等[13]的研究結(jié)果接近。

PTGS1位點(diǎn)突變?cè)趷?ài)爾蘭人群中頻率為6%，而本研究結(jié)果顯示，其在中國(guó)人群中的頻率較低，約為0.56%，表明人種差異是遺傳藥理學(xué)研究的重要影響因素。

本研究結(jié)果表明，在患者服用阿司匹林之前，檢測(cè)其阿司匹林抗血小板療效相關(guān)基因突變情況，可預(yù)估其抗血小板治療反應(yīng)，從而為患者制訂個(gè)體化的治療方案，減少血栓栓塞事件發(fā)生。相較于服藥后監(jiān)測(cè)患者血小板聚集率及血栓彈力素等判定該藥對(duì)患者是否有效，基因檢測(cè)更方便、快捷，可提前預(yù)判患者是否會(huì)產(chǎn)生抵抗，最大限度地保障藥物的有效性和安全性。本研究不足之處在于開(kāi)展時(shí)間不長(zhǎng)，樣本量不足，且未獲得患者的預(yù)后信息，下一步可繼續(xù)擴(kuò)大樣本量，同時(shí)持續(xù)追蹤患者的預(yù)后信息進(jìn)行研究，為臨床合理使用阿司匹林提供更有力的循證依據(jù)。