吡羅紅、甲基綠與核酸染色反應(yīng)實(shí)驗(yàn)探究

敖 蘭 郝連振 王紅蕊

（1 保定市第一中學(xué) 河北保定 071000 2 石家莊第十五中學(xué) 河北石家莊 050000）

人教版生物必修1《分子與細(xì)胞》中，第2 章“組成細(xì)胞的分子”第3 節(jié)安排了一個(gè)實(shí)驗(yàn)——“觀察DNA 和RNA 在細(xì)胞中的分布”。該實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)了從初中宏觀、個(gè)體層面的教學(xué)到高中微觀、分子水平的教學(xué)轉(zhuǎn)折，但在實(shí)際教學(xué)中該實(shí)驗(yàn)的開出率及成功率都不盡人意。本文在大量實(shí)驗(yàn)探究的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了4 個(gè)方面的改進(jìn)：降低藥品濃度、改變藥品配方和實(shí)驗(yàn)類型、簡(jiǎn)化操作步驟、更換實(shí)驗(yàn)材料，從而使實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象更清晰，更易于學(xué)生操作，成功率更高。

1 改進(jìn)原因

該實(shí)驗(yàn)源自大學(xué)生物學(xué)專業(yè)（尤其是醫(yī)學(xué)專業(yè)）的一個(gè)常規(guī)實(shí)驗(yàn)——“Brachet（布拉奇特）反應(yīng)”，吡羅紅和甲基綠的混合染液稱為“Unna（溫納）”試劑。該方法出現(xiàn)于1901年，Unna［1］在1910年又對(duì)試劑進(jìn)行了改良，使實(shí)驗(yàn)效果更加明顯，所以這是個(gè)成熟的實(shí)驗(yàn)。自2004年選入高中生物學(xué)教材以來，有關(guān)該實(shí)驗(yàn)改進(jìn)的文章也頻頻出現(xiàn)，但對(duì)該實(shí)驗(yàn)在高中階段的開展都沒有實(shí)質(zhì)性的影響。

1.1 教材描述不清楚 教材是這樣表述的：“吡羅紅甲基綠染色劑取A 液20 mL、B 液80 mL 配成染色劑，使用時(shí)現(xiàn)用現(xiàn)配。A 液：取吡羅紅甲基綠粉1 g，加入100 mL 蒸餾水中溶解，放入棕色瓶備用?！边@段描述只說吡羅紅甲基綠粉1 g，沒說明吡羅紅甲基綠的比例，而通常購買的是分裝的吡羅紅粉和甲基綠粉。

1.2 實(shí)驗(yàn)費(fèi)用偏高 以上海Regal Biotechnology Company提供的報(bào)價(jià)來看，該實(shí)驗(yàn)所需的2 種藥品的價(jià)格分別為：5 g 吡羅紅370 元、10 g 甲基綠178 元，這2 種藥品在高中生物學(xué)常規(guī)實(shí)驗(yàn)中是費(fèi)用最高的。按照教材配方，假定吡羅紅甲基綠的比例是1∶1，A 液20 mL、B 液80 mL 配成染色劑，每瓶吡羅紅（5 g）和甲基綠（10 g）能配5 000 mL溶液?，F(xiàn)階段高中生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室通常是按照28 組配備，按每年級(jí)20 個(gè)班計(jì)算，有的學(xué)校購買一次藥品只能做1～2 次學(xué)生實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)效果不能保證 選取該實(shí)驗(yàn)時(shí)，完全按照大學(xué)教材中的操作方法引進(jìn)。而大學(xué)一般是按照制作玻片標(biāo)本的步驟進(jìn)行操作。玻片標(biāo)本制作步驟如下：取材、固定、沖洗、染色、脫水、透明、封片，每步都有相應(yīng)的時(shí)間，步驟不能簡(jiǎn)化、時(shí)間不能縮短、濃度不能降低，否則其制作的標(biāo)本達(dá)不到最佳的觀察效果且不能長(zhǎng)期保存［2］。大學(xué)的實(shí)驗(yàn)課通常都是按照半天時(shí)間安排，可按照操作步驟進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)效果也不會(huì)出問題，而高中實(shí)驗(yàn)課只有40 min 或45 min，時(shí)間有限，無法保證實(shí)驗(yàn)的效果。

2 改進(jìn)方案

2.1 降低藥品濃度 針對(duì)多數(shù)學(xué)校出現(xiàn)染色較深，細(xì)胞核呈現(xiàn)紅色而不是綠色的情況，筆者嘗試降低藥品的濃度。利用梯度法，甲基綠從2%開始降低濃度進(jìn)行配制，吡羅紅從5%開始降低濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，最終確定染色效果最佳的最小濃度為：甲基綠0.03%，吡羅紅0.03%。從而減少了染料使用量，降低了實(shí)驗(yàn)成本。

2.2 改變藥品配方 Brachet 反應(yīng)主要是利用核酸分子上的磷酸根（-PO43-）和堿性染料形成鹽鍵而在原位沉淀顯色，DNA 和RNA 都有磷酸根（-PO43-），故能同時(shí)和堿性染料結(jié)合。由于DNA 分子和RNA 分子的聚合程度有差別，Unna 試劑中的甲基綠優(yōu)先和DNA 分子相結(jié)合，而吡羅紅更多地與RNA 分子相結(jié)合，從而表現(xiàn)出不同的顏色，顯示細(xì)胞內(nèi)RNA 與DNA 的分布位置［3］。

然而筆者按照有些資料介紹的吡羅紅甲基綠比例進(jìn)行操作，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)都呈現(xiàn)紅色，沒有體現(xiàn)甲基綠的顏色。因此改變了2 種染料的使用比例，分別按照吡羅紅∶甲基綠為3∶1、2∶1、1∶1 的比例操作，最終確定當(dāng)比例為1∶1 時(shí)，能觀察到清晰的綠色的細(xì)胞核。

2.3 簡(jiǎn)化操作步驟 教材以口腔上皮細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，但口腔上皮細(xì)胞在顯微鏡下數(shù)量少、體積小、染色不充分，從而不易觀察。于是筆者用洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料，省略了針對(duì)口腔上皮細(xì)胞進(jìn)行的烘干操作。

其次，由于該反應(yīng)對(duì)酸堿度敏感，而緩水流沖洗不能徹底去除鹽酸，因此嘗試將材料直接放在染液中進(jìn)行染色，結(jié)果現(xiàn)象更加清晰，從而去掉水解和緩水流沖洗2 個(gè)步驟。這樣實(shí)驗(yàn)步驟從6 個(gè)減少為3 個(gè)，即為制片、染色、觀察，極大節(jié)省了時(shí)間，有利于學(xué)生在有限時(shí)間內(nèi)對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行思考和討論。

2.4 改變實(shí)驗(yàn)類型 在該實(shí)驗(yàn)中，為何要用吡羅紅和甲基綠混合染劑染色，而不是先用一種染劑再用另一種染劑染色？也是一個(gè)重要的考點(diǎn)。為了讓學(xué)生通過探究理解這一問題，筆者改變了實(shí)驗(yàn)類型，將觀察實(shí)驗(yàn)改為探究實(shí)驗(yàn)。將實(shí)驗(yàn)分為4組：分別用甲基綠染劑、吡羅紅染劑、甲基綠和吡羅紅混合液（體積比1∶1）和加入pH=4.8 緩沖液的甲基綠吡羅紅混合液對(duì)洋蔥表皮細(xì)胞進(jìn)行染色觀察。

3 改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn)操作

實(shí)驗(yàn)試劑：0.03%甲基綠染液，0.03%吡羅紅染液（甲基綠粉和吡羅紅粉均購買自上海Regal Biot-echnology Company，2009年生產(chǎn)），pH=4.8 緩沖液（以下染液濃度均為0.03%，不再重復(fù)說明）。

實(shí)驗(yàn)用具：數(shù)碼顯微鏡、普通顯微鏡、載玻片、蓋玻片、牙簽、鑷子等。

實(shí)驗(yàn)材料：洋蔥內(nèi)表皮。

實(shí)驗(yàn)時(shí)間：40 min。

實(shí)驗(yàn)步驟：①制片。

表1 實(shí)驗(yàn)分組

取2 個(gè)載玻片，第1 個(gè)載玻片的左、右2 個(gè)位置分別滴加1、2 組染液各1 滴,第2 個(gè)載玻片的左、右2 個(gè)位置分別滴加3、4 組染液各1 滴；在每種試劑里分別加入洋蔥內(nèi)表皮并用鑷子展開（如果先將洋蔥內(nèi)表皮展開在載玻片上，其易因干燥而卷在一起；如果將洋蔥內(nèi)表皮先用清水濕潤(rùn)，則會(huì)改變?cè)噭舛龋?；蓋上蓋玻片并用吸水紙吸去多余試劑。

②觀察。制好裝片后，即可進(jìn)行觀察；數(shù)碼顯微鏡用于在前臺(tái)為學(xué)生展示理想的實(shí)驗(yàn)效果，并比較分析4 組實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在40 倍物鏡下，觀察得到如圖1～圖4（本文附圖見封四）所示圖像。由于簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟，改變了實(shí)驗(yàn)類型，學(xué)生在有限的一節(jié)課的時(shí)間里，能更充分地進(jìn)行思考討論。以下是遵循對(duì)照原則，進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：①通過1、2 組對(duì)照，學(xué)生強(qiáng)化了對(duì)甲基綠和吡羅紅都能使DNA、RNA 染色的認(rèn)識(shí)；②通過1、2、3 組對(duì)照，學(xué)生得出甲基綠和吡羅紅與核酸的結(jié)合程度有差異； ③通過3、4 組對(duì)照，學(xué)生得出該顏色反應(yīng)對(duì)酸堿度敏感的結(jié)論。

5 實(shí)驗(yàn)拓展

最后，筆者用該試劑，按照教材中“有絲分裂觀察”的實(shí)驗(yàn)步驟對(duì)大蒜根尖進(jìn)行染色，結(jié)果如圖5和圖6（40 倍物鏡），發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象比教材中龍膽紫染色更為清晰。

總之，通過該實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn)，筆者深切體會(huì)到任何實(shí)驗(yàn)都有它的局限性，當(dāng)受到外界條件影響時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)不合預(yù)期的問題。作為一線工作者要因地制宜，在把握實(shí)驗(yàn)原理不變的前提下，勇于探究實(shí)驗(yàn)方法，更好地為實(shí)驗(yàn)教學(xué)服務(wù)，使學(xué)生的觀察能力、操作水平得到提升，邏輯思維能力和思維拓展能力得到進(jìn)一步鍛煉。