活血益氣中藥抑制心梗后心衰大鼠左室重構(gòu)和心肌細胞凋亡的實驗研究*

張海燕 遲春梅 劉天易

（1.山東省青島市即墨區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，山東 青島 266200；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東濟南 250100）

心肌梗死為常見多發(fā)性心血管病，是一種復(fù)雜的臨床綜合征，是由于冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂，血小板和凝血功能異常，血栓完全阻塞冠狀動脈所致。心梗后心衰發(fā)展過程的重要病理機制為心肌重塑，包括心室大小、形態(tài)及細胞水平變化，心肌細胞的缺失和心室重構(gòu)下降使心臟功能下降［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)VEGF可形成新的血管，增加血管的通透性，血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）下降抑制心肌細胞肥大和膠原產(chǎn)生，內(nèi)皮素-1

（ET-1）血管收縮劑和促細胞分裂劑，ET-1生成和釋放，刺激肺血管持續(xù)收縮［3-4］。Bcl-2和Bax為Bcl-2家族成員，主要調(diào)節(jié)細胞凋亡，決定細胞的生存或死亡，可調(diào)控心梗后心衰促凋亡和抗凋亡［5］?；钛鏆庵兴帉π墓：笮乃ゾ哂休^好的臨床療效，但其作用機制尚不明確［6-7］。因此，本研究旨在探討早期應(yīng)用活血益氣中藥抑制心梗后心衰大鼠左室重構(gòu)和心肌細胞凋亡的作用特點?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 30只健康雄性清潔級SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（250±20）g。北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號：SCXK（京）2011-0011。自然光線，分籠飼養(yǎng)，標準喂養(yǎng)。

1.2 試藥與儀器 活血益氣方：丹參15 g，川芎20 g，紅花15 g，黃芪20 g，赤芍10 g，黨參10 g。藥材均為筆者所在醫(yī)院中藥房提供，取處方藥材，加8倍量水煎煮2次，濾過，并制成生藥含量1 g/mL的煎煮液。卡托普利（廣東彼迪藥業(yè)有限公司），水合氯醛（國藥集團化學(xué)試劑有限公司），HE染色液（Sigma公司），VEGF、ET-1試劑盒購于武漢博士德生物技術(shù)有限公司，AngⅡ試劑盒購于北京富瑞生物工程公司。TUNEL原位細胞凋亡檢測試劑盒美國eBioscience公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成。OLYMPUSAU5400全自動生化分析儀，日本奧林巴斯有限公司；SMZ660熒光顯微鏡，日本尼康公司；Bioteka Quant型酶標儀，上海坤肯生物化工有限公司；DH-140B型小動物呼吸機，浙江醫(yī)科大學(xué)實驗儀器廠。

1.3 模型制備 40只SD大鼠飼養(yǎng)1周，水合氯醛麻醉大鼠后，固定于手術(shù)臺，碘酒消毒，在左胸第4肋骨間作橫切口，打開胸腔，使心臟充分暴露于外，剝離心包膜，冠狀動脈前降支起點處結(jié)扎前降支、心臟搏動稍減弱，心電圖出現(xiàn)ST段上抬，抬高到弓背向上為造模成功。逐層縫合皮膚，清除術(shù)野，關(guān)閉切口。腹腔注射青霉素3 d，200萬/（kg·d），預(yù)防感染［8-9］。假手術(shù)組大鼠手術(shù)過程同上，只穿線但不結(jié)扎冠脈。

1.4 分組與給藥 將模型大鼠隨機分為中藥組、西藥組和模型組，每組10只。中藥組給予活血益氣方灌胃，5 mL/kg，每日1次。西藥組給予卡托普利灌胃，劑量為100 mg/kg，每日1次。對照組和模型組給予0.9%氯化鈉注射液灌胃，5 mL/kg，每日1次。連續(xù)灌胃4周。

1.5 標本采集與檢測 采用小動物呼吸機檢測左室收縮內(nèi)徑（LVS）、左室舒張內(nèi)徑（LVD）、左室射血分數(shù)（EDV）和左室每搏輸出量（SV）。檢測完心功能后，剪開胸腔，迅速取出心臟，0.9%氯化鈉注射液清洗后，10%甲醛固定液固定48 h后，二甲苯脫脂，酒精脫水，石蠟包埋，切片，HE染色。取血清，采用雙抗體夾心-ELISA法定量測定的VEGF、AngⅡ和ET-1水平，嚴格按照說明書操作。TUNEL試劑盒檢測心肌細胞凋亡，凋亡指數(shù)（AI）=凋亡心肌細胞數(shù)÷心肌細胞總數(shù)×100%。取心肌組織提取RNA，檢測提取的RNA純度，RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，采用RT-PPCR法檢測凋亡基因Bcl-2和Bax mRNA水平，采用Primer Premier 5.0引物設(shè)計軟件，據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）公布的大鼠Bcl-2和Bax基因序列，設(shè)計引物，引物序列見表1。95℃變性，60℃退火，40個循環(huán)。計3個復(fù)孔，以重水為陰性對照。根據(jù)標準曲線及待測樣本二階導(dǎo)數(shù)最大分析法計算的Ct值，計算mRNA含量。

表1 RT-PCR所用引物序列

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，t檢驗比較組內(nèi)和組間差異，計數(shù)資料以n（%）表示，χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 各組大鼠病理組織比較 對照組心肌細胞正常，無壞死，模型組心肌細胞壞死，結(jié)締組織增生，中藥組和西藥組心肌細胞壞死減少，存在輕微結(jié)締組織增生。見圖1。

圖1 心肌組織病組織（HE染色，40倍）

2.2 各組大鼠心功能指標比較 見表2。中藥組和西藥組左室LVS和LVD顯著低于模型組，左室EDV和SV顯著高于模型組（P＜0.05）。

表2 各組心功能指標比較（±s）

表2 各組心功能指標比較（±s）

與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同

組別對照組模型組中藥組西藥組n 10 10 10 10 LVS（mm）0.73±0.09 0.57±0.04*0.39±0.05*△0.37±0.04*△LVD（mm）0.53±0.07 0.72±0.05*0.66±0.04*△0.65±0.04*△EDV（%）67.14±4.59 41.23±3.12*48.12±3.74*△46.43±3.62*△SV（mL）75.12±18.67 48.47±12.86*59.57±13.45*△61.15±12.56*△

2.3 各組大鼠VEGF、AngⅡ和ET-1水平比較 見表3。中藥組和西藥組VEG、AngⅡ和ET-1水平顯著低于模型組（P＜0.05）。

表3 各組大鼠VEGF、AngⅡ和ET-1水平比較（±s）

表3 各組大鼠VEGF、AngⅡ和ET-1水平比較（±s）

組別對照組模型組中藥組西藥組n 10 10 10 10 VEGF（pg/mL）142.14±22.34 243.21±42.49*167.19±21.35*△164.47±20.61*△AngⅡ（ng/mL）1.71±0.32 3.12±0.41*2.03±0.35*△1.98±0.31*△ET-1（%）45.37±7.24 68.47±8.26*52.12±6.21*△51.43±5.69*△

2.4 各組大鼠Bcl-2、Bax mRNA和AI水平比較 見表4。中藥組和西藥組Bcl-2 mRNA水平顯著高于模型組Bax mRNA顯著低于模型組（P＜0.05），中藥組和西藥組AI顯著低于模型組，且低于對照組（P＜0.05）。

圖2 各組心肌細胞的凋亡情況（400倍）

3討 論

心肌梗死后左心室擴張和收縮功能障礙，冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂，心肌細胞死亡伴隨有大量心肌細胞凋亡，心肌細胞肥大和間質(zhì)增生，隨著病情的發(fā)展，心肌細胞凋亡持續(xù)存在，心肌細胞缺失和心室重構(gòu)是心衰的主要原因［10-11］。心肌細胞凋亡激活神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，增加血清VEGF、AngⅡ和ET-1表達，促進心肌細胞肥大和膠原產(chǎn)生，體內(nèi)水、鈉潴留，進一步損害心臟舒縮功能，導(dǎo)致心肌肥厚、心室重構(gòu)和纖維化［12］。ET-1通過加重心臟負荷，損傷缺血再灌注，加重心肌缺血［13］。利尿劑是治療心衰的首選藥，可減輕體肺循環(huán)淤血及心臟前負荷，其不能被其他心血管藥物替代，常用藥物還有血管擴張劑、鈣增敏劑、促紅細胞生成素、內(nèi)皮素Ⅰ拮抗劑等，藥品造價昂貴難以推廣［14］。中醫(yī)心衰屬于胸痹、痰飲、心水等范疇，心氣虛是其基本的病機，外因多為風(fēng)、寒、濕、熱等，內(nèi)因多為飲食失宜，臟腑內(nèi)傷，本虛標實，本虛為氣虛為主，血瘀為其標，治宜活血益氣［15］。

本研究發(fā)現(xiàn)，對照組心肌細胞正常，無壞死，模型組心肌細胞壞死，結(jié)締組織增生，中藥組和西藥組心肌細胞壞死減少，存在輕微結(jié)締組織增生，說明活血益氣中藥可改善心梗后心衰大鼠病理組織，這與丹參可抑制心肌成纖維細胞分裂，川芎、紅花均活血化瘀，提高細胞內(nèi)超氧化物歧化酶的生物活性，改善局部血液循環(huán)，抑制平滑肌細胞及成纖維細胞增生有關(guān)［16-17］。中藥組和西藥組左室LVS和LVD顯著低于模型組，左室EDV和SV顯著高于模型組，說明活血益氣中藥可改善心梗后心衰大鼠心功能。黃芪強心苷改善心室肌收縮和舒張，有效逆轉(zhuǎn)損傷心室，黨參、黃芪改善心臟的收縮、舒張功能，川芎、紅花抗凝、抗氧化、擴張血管、改善微循環(huán)以及保護血管內(nèi)皮有關(guān)［18-19］。中藥組和西藥組VEGF、AngⅡ和ET-1顯著低于模型組，說明活血益氣中藥可降低心梗后心衰大鼠VEGF、AngⅡ和ET-1表達。川芎促進心肌梗死后大鼠缺血心肌血管新生，減少左心室重構(gòu)，改善心功能，提高心肌抗缺血能力，修復(fù)損傷心肌細胞，降低VEGF、AngⅡ和ET-1表達［20］。中藥組和西藥組Bcl-2 mRNA水平顯著高于模型組，Bax mRNA顯著低于模型組，說明活血益氣中藥可改善心梗后心衰大鼠凋亡基因?；钛鏆夥娇梢种菩募〖毎蛲?，促進心肌抗凋亡基因的表達，改善心功能，降低心肌細胞凋亡數(shù)。

表3 各組大鼠Bcl-2、Bax mRNA和AI比較（±s）

表3 各組大鼠Bcl-2、Bax mRNA和AI比較（±s）

組 別n Bcl-2 mRNA Bax mRNA AI（%）10 10 10 10對照組模型組中藥組西藥組1.00±0.14 0.15±0.03*0.51±0.06*△0.53±0.07*△1.00±0.09 1.69±0.11*1.17±0.09*△1.15±0.1*△15.12±2.24 71.47±5.26*46.12±4.37*△47.01±3.78*△

綜上所述，活血益氣中藥可抑制心梗后心衰大鼠左室重構(gòu)和心肌細胞凋亡，可能與改善心功能、VEGF、AngⅡ和ET-1表達，調(diào)控心肌基因表達有關(guān)。