谷紅注射液對新生大鼠腦缺氧缺血損傷的保護作用研究*

袁 丹 常能彬 梁玉蘭 李 茂

（1.四川省瀘州市人民醫(yī)院，四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學，四川 瀘州 646000）

新生兒缺氧缺血性腦病是威脅新生兒生命健康的主要疾病之一，可造成新生兒永久性神經(jīng)功能障礙，目前臨床以對癥支持治療為主，尚無特效療法。谷紅注射液是一種復方制劑，由乙酰谷酰胺和紅花提取液制成，具有抗氧自由基、活血化瘀、改善微循環(huán)等多種功效［1］。氧化應激產(chǎn)生大量自由基和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物損傷腦細胞，在腦損傷的作用機制中發(fā)揮重要作用［2］。細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）/核因子E2相關(guān)因子2（nuclear Nrf2）/血紅素加氧酶1（HO-1）通路是抗氧化防御系統(tǒng)中的重要信號通路，可通過清除自由基等降低氧化應激反應［3］。本研究觀察谷紅注射液對缺氧缺血新生大鼠腦損傷的保護作用并探討其分子機制，為缺血性腦疾病的治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 126只健康7 d齡SD新生大鼠，體質(zhì)量8～15 g，購自西南醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（川）2017-0003。在光照和黑暗環(huán)境交替、相同溫度和濕度條件下，由母鼠自由喂養(yǎng)。

1.2 試藥與儀器 谷紅注射液，通化谷紅制藥有限公司，國藥準字H22026637，批號20150925；ERK抑制劑SCH772984，純度98.06%，MCE中國；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSPPx）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；ERK和p-EERK抗體，美國Santa Cruz公司；Nrf2和HO-1抗體，英國Abcam公司，貨號ab128075；β-actin和FITC標記山羊抗兔IgG，北京中杉金橋科技有限公司；ELx800-MV型酶聯(lián)免疫檢測儀，美國Bio-Tek公司；XS205型電子天平，瑞士梅特勒-托利多科學儀器；Chemi Doc TM XRS+型凝膠成像儀及電泳儀，美國Bio-Rad公司。

1.3 造模與分組 從126只新生大鼠中隨機選取18只作為假手術(shù)組，其余新生大鼠參照文獻方法建立缺氧缺血模型［4］。腹腔注射10%水合氯醛（350 mg/kg），麻醉后仰臥位固定于手術(shù)板上，75%酒精消毒，頸部正中切口，結(jié)扎鼠左側(cè)頸總動脈，縫合切口。術(shù)后恢復2 h，將新生大鼠置于缺氧箱中，通入8%O2和92%N2的混合氣體，氣流量2.0 L/min，缺氧2 h。假手術(shù)組大鼠除不結(jié)扎左側(cè)頸總動脈之外，其他處理相同。缺氧缺血新生大鼠隨機分為模型組，谷紅低、中、高劑量組，ERK抑制劑LY3214996組（ERK組）和ERK+谷紅組。

1.4 給藥方法 造模結(jié)束4 h后給藥。谷紅低、中、高劑量組分別按劑量2.5、5、10 mL/kg腹腔注射谷紅注射液［5］；ERK 組按劑量 10 μL/kg腹腔注射 LY3214996（5 nmol/L）［6］；ERK+谷紅組同時腹腔注射LY3214996和10 mL/kg谷紅注射液；假手術(shù)組和模型組腹腔注射等量（10 mL/kg）生理鹽水。每12小時給藥1次，共給藥5次。

1.5 大鼠神經(jīng)功能缺陷評分 給藥結(jié)束后，從每組中隨機選取6只，參照文獻方法對各組大鼠神經(jīng)功能缺陷進行評分［7］。神經(jīng)功能無缺陷記為0分；左側(cè)前肢伸展不完全，為輕度神經(jīng)功能缺損，記為1分；新生大鼠在行走過程中轉(zhuǎn)圈，為中度神經(jīng)功能缺損，記為2分；新生大鼠在行走過程中傾倒，為重度神經(jīng)功能缺損，記為3分；新生大鼠意識不清，不能自發(fā)行走，記為4分。神經(jīng)功能缺損評分越高，說明新生大鼠損傷越嚴重。

1.6 標本采集與檢測 1）大鼠腦組織HE染色：各組大鼠神經(jīng)功能缺陷評分后，腹腔注射10%水合氯醛（350 mg/kg），麻醉后打開胸腔，生理鹽水灌注心臟，去除血液，后改用4%多聚甲醛灌注，大鼠全身僵硬后，立即取出腦組織，采用4%多聚甲醛固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片后HE染色，置于光學顯微鏡下觀察各組新生大鼠腦組織病理變化。2）大鼠腦組織含水量檢測［8］：隨機取每組大鼠各6只，斷頭處死，快速取出腦，從矢狀縫切開，稱取新生大鼠右腦組織質(zhì)量為濕質(zhì)量。置于100℃烘箱中烘24 h，稱量記為干質(zhì)量。腦組織含水量（%）=（腦組織濕質(zhì)量-腦組織干質(zhì)量）/腦組織濕質(zhì)量×100%。3）大鼠腦組織MDA、SOD和GSP-Px測定：取剩余新生大鼠缺血側(cè)腦組織，沖洗除去殘血，用濾紙吸干后立即精確稱質(zhì)量，加入4℃預冷的生理鹽水制成10%組織勻漿，離心（4 000 r/min，10 min）后取上清液，-20℃保存?zhèn)溆?。嚴格按照MDA、SOD和GSP-Px試劑盒操作說明檢測各指標。4）Western blotting法檢測大鼠腦組織p-ERK、Nrf2和HO-1蛋白表達：取適量各組新生大鼠腦組織，加入預冷的蛋白裂解液于冰上裂解30 min，離心（4℃，12 000 r/min，10 min），取上清液-80℃保存?zhèn)溆?。BCA法測定蛋白濃度。取30 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后半干法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后，加入一抗，4℃孵育過夜。沖洗后加入二抗，室溫孵育2 h。沖洗后ECL顯色，以β-actin為內(nèi)參，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計學處理 應用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。計數(shù)資料用n表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分及腦組織含水量比較 見表1。假手術(shù)組新生大鼠無神經(jīng)功能缺損癥狀，模型組新生大鼠在行走時出現(xiàn)轉(zhuǎn)圈、意識不清、無法正常行走等現(xiàn)象。與假手術(shù)組比較，模型組新生大鼠神經(jīng)功能缺損評分、腦組織含水量均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，谷紅中劑量組、谷紅高劑量組和ERK+谷紅組新生大鼠神經(jīng)功能缺損評分及腦組織含水量均顯著降低（P＜0.05）。與ERK組比較，ERK+谷紅組新生大鼠神經(jīng)功能缺損評分及腦組織含水量均顯著降低（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠腦組織病理變化比較 見圖1。假手術(shù)組新生大鼠腦組織結(jié)構(gòu)清晰，細胞排列規(guī)則，細胞輪廓正常，中央有細胞核，核仁明顯。模型組神經(jīng)細胞排列紊亂，極性不清，細胞萎縮、核固縮，神經(jīng)細胞退化、壞死和凋亡，一些細胞表現(xiàn)出核凝結(jié)和間質(zhì)水腫，空泡變性和核結(jié)構(gòu)不清楚。谷紅高劑量組腦組織細胞明顯改善，形態(tài)接近假手術(shù)組，凋亡和壞死細胞較模型組顯著減少。ERK組腦組織細胞與模型組變化相似，細胞出現(xiàn)核萎縮等現(xiàn)象，ERK+谷紅組細胞形態(tài)較ERK組也顯著改善，壞死細胞減少。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分及腦組織含水量比較（±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分及腦組織含水量比較（±s）

與假手術(shù)組比較，◇P＜0.05；與模型組比較，◆P＜0.05；與谷紅高劑量組比較，△P＜0.05；與ERK組比較，▲P＜0.05。下同

組別假手術(shù)組模型組谷紅低劑量組谷紅中劑量組谷紅高劑量組ERK組ERK+谷紅組n 6 6 6 6 6 6 6神經(jīng)功能缺損評分（分）0 3.74±0.27◇3.61±0.24 2.63±0.19◆1.02±0.08◆3.82±0.36 2.51±0.18◆△▲腦組織含水量（%）80.07±5.97 96.98±6.43◇90.04±6.59 88.31±6.51◆81.75±6.05◆98.43±7.26 88.97±5.02◆△▲

圖1 各組大鼠腦組織病理觀察（HE染色，400倍）

2.3 各組大鼠腦組織MDA、SOD和GSP-Px表達比較 見表2。與假手術(shù)組比，模型組新生大鼠腦組織MDA顯著升高（P＜0.05），SOD和GSP-Px活力顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，谷紅中劑量組、谷紅高劑量組和ERK+谷紅組新生大鼠腦組織MDA顯著降低，SOD和GSP-Px活力顯著升高（P＜0.05）。與ERK組比，ERK+谷紅組新生大鼠腦組織MDA顯著降低，SOD和GSP-Px活力顯著升高（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠腦組織ERK/Nrf2/HO-1通路相關(guān)蛋白表達比較 見表3。與假手術(shù)組比較，模型組新生大鼠腦組織p-ERK、Nrf2、HO-1蛋白表達顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，谷紅中劑量組、谷紅高劑量組和ERK+谷紅組新生大鼠腦組織p-ERK、Nrf2、HO-1蛋白表達顯著升高（P＜0.05）。與ERK組比較，ERK+谷紅組新生大鼠腦組織p-ERK、Nrf2、HO-1蛋白表達顯著升高（P＜0.05）。

表2 各組大鼠腦組織MDA、SOD和GSP-Px表達比較（±s）

表2 各組大鼠腦組織MDA、SOD和GSP-Px表達比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組谷紅低劑量組谷紅中劑量組谷紅高劑量組ERK組ERK+谷紅組n 6 6 6 6 6 6 6 MDA（nmol/mg）1.52±0.25 5.46±1.15◇5.09±1.08 3.61±0.67◆2.21±0.28◆5.61±1.19 3.94±0.72△▲SOD（U/mg）17.85±1.63 5.72±1.05◇6.43±1.26 10.15±1.38◆14.98±1.57◆5.16±0.98 11.85±1.43△▲GSP-Px（U/mg）54.28±5.62 15.43±2.51◇17.15±2.68 32.85±4.19◆50.51±5.04◆14.02±2.48 28.26±2.92△▲

表3 各組大鼠腦組織p-ERK、Nrf2、HO-1蛋白表達比較（±s）

表3 各組大鼠腦組織p-ERK、Nrf2、HO-1蛋白表達比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組谷紅低劑量組谷紅中劑量組谷紅高劑量組ERK組ERK+谷紅組n 6 6 6 6 6 6 6 p-ERK 1.12±0.13 0.10±0.01◇0.12±0.02 0.36±0.02◆0.91±0.10◆0.09±0.01 0.63±0.08◆△▲Nrf2 1.02±0.09 0.12±0.01◇0.13±0.02 0.37±0.03◆0.82±0.08◆0.11±0.02 0.54±0.05◆△▲HO-1 1.13±0.14 0.32±0.02◇0.33±0.03 0.42±0.04◆0.78±0.09◆0.26±0.03 0.51±0.04◆△▲

圖2 各組大鼠腦組織p-ERK、Nrf2、HO-1蛋白表達

3討論

氧化應激是腦損傷的主要機制之一。腦缺血缺氧可使抗氧化防御系統(tǒng)受損，氧自由基的產(chǎn)生和清除的動態(tài)平衡受到破壞，導致機體內(nèi)活性氧（ROS）累積，引起氧化應激［9］。谷紅注射液可增加腦缺血再灌注（I/R）大鼠腦組織GSH-Px活性，降低LDH含量，對I/R大鼠發(fā)揮腦保護作用［10］。谷紅注射液可降低氧糖剝奪損傷大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞NO和MDA含量，高SOD和GSH-PX活性，改善細胞形態(tài)，減少缺氧誘導的凋亡細胞數(shù)量，其機制可能與增強細胞抗氧化能力和抑制細胞凋亡有關(guān)［11］。本研究結(jié)果顯示，新生大鼠在缺血缺氧后，神經(jīng)功能評分和腦組織含水量顯著升高，腦組織MDA顯著升高，SOD和GSP-Px活力顯著下降。谷紅注射液主要是由乙酰谷酰胺和紅花提取物制成的滅菌水溶液，紅花提取液中有效成分為紅花苷類和紅花黃色素，具有擴張血管的作用，增加腦組織抗缺血缺氧能力；乙酰谷酰胺可經(jīng)血腦屏障維持神經(jīng)應激能力，改善腦功能［12］。現(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，谷紅注射液可降低膠質(zhì)細胞和海馬神經(jīng)元Caspase-3酶活性，抑制紅細胞聚集，從而降低全血黏度，還可提高纖維蛋白溶解酶活性，加快血栓溶解，增加腦血流量，改善腦循環(huán)［13］。本研究發(fā)現(xiàn)谷紅注射液干預后，可降低缺氧缺血新生大鼠神經(jīng)功能缺損評分、腦組織含水量、腦組織MDA含量，提高SOD和GSP-Px活力，提示谷紅注射液可通過提高抗氧化酶活性降低氧自由基對腦組織的損傷。

ERK/Nrf2/HO-1信號通路的激活可降低細胞或組織中的氧自由基，保護細胞或組織免受損傷。Nrf2作為亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄激活因子家族成員，機體受到氧化應激刺激時，Nrf-2與細胞骨架相關(guān)蛋白發(fā)生解離后進入細胞核，進而促進HO-1蛋白的表達，磷酸化的ERK可以促進Nrf2激活［14-15］。HO-1對細胞具有保護作用，可催化血紅素產(chǎn)生膽綠素和鐵等物質(zhì)，膽綠素可形成膽紅素，二者是體內(nèi)強有力的自由基清除劑［16］。馬慧萍等研究發(fā)現(xiàn)，急慢性腦缺血大鼠神經(jīng)功能學評分、梗死體積顯著增加，GSH-Px和SOD活力、Nrf2和HO-1蛋白表達降低，白楊素可激活Nrf2/HO-1通路，減輕急慢性腦缺血損傷，對海馬神經(jīng)損傷起保護作用［17］。本研究結(jié)果顯示，缺氧缺血新生大鼠腦組織蛋白表達顯著下調(diào)，谷紅注射液干預后，p-ERK、Nrf2、HO-1蛋白表達顯著上調(diào)。且與ERK抑制劑組比較，ERK抑制劑和谷紅注射液共同干預后，新生大鼠SOD和GSP-Px活力、p-ERK、Nrf2、HO-1蛋白表達較均顯著升高，神經(jīng)功能缺損評分和腦組織含水量以及MDA含量均顯著降低，提示谷紅注射液可激活ERK/Nrf2/HO-1信號通路，促進p-ERK、Nrf2、HO-1蛋白表達降低了腦組織氧化應激，進而對缺氧缺血新生大鼠發(fā)揮腦保護作用。

綜上所述，谷紅注射液可降低缺氧缺血新生大鼠神經(jīng)功能缺損評分，減輕腦水腫和病理學損傷，提高腦組織抗氧化酶活性，對缺氧缺血新生大鼠神發(fā)揮腦保護作用，其作用機制可能與激活ERK/Nrf2/HO-1信號通路相關(guān)。